大黃素對P2X2/3受體介導的三叉神經痛的作用研究

吳饒平，熊 偉，歐曉艷，劉 晗，邱淑怡，李桂林，徐昌水，劉雙梅，梁尚棟，高 云

(南昌大學1.基礎醫學院生理學教研室、2.附屬口腔醫院預防科，江西南昌 330006)

三叉神經痛(trigeminal neuralgia，TN)是一種病因不明，單側撕裂性或電擊性陣痛的慢性疼痛綜合癥，臨床上發病率較高，但治療困難，對患者及家屬的生活造成極大的痛苦［1－2］。目前雖然治療藥物較多，但有效而副作用小的藥很少，而且容易發生耐藥［3－4］。因此我們有必要尋找TN治療新的更有效的方法。目前大量研究證實，ATP及其類似物作用的P2X嘌呤受體在傷害性感受信號傳遞過程中起著重要作用［5－8］，其中 P2X2/3受體和痛覺傳遞關系最為密切，且可能參與三叉神經痛的發生。大黃素(emodin)是中藥大黃的主要有效成分，化學名為1，3，8-三羥基-6 甲基蒽醌(1，3，8-trihydroxy-6methy lanthraquinone)，分子式為 C15H10O5，分子量為270.23，化學結構屬于羥基蒽醌類，其藥理作用主要集中在抑制細胞增殖、抗炎、抑制肝臟和腎臟纖維化等方面。有實驗結果顯示大黃素通過多種途徑產生抗炎作用［9］。永久性的神經病理痛有神經炎性及神經免疫性作用［10］。所以大黃素可能通過其抗炎及免疫抑制作用緩解外周神經疼痛［11］。目前還不清楚大黃素是否影響慢性疼痛的信息傳遞。ATP是神經調質，P2X2/3參與神經病理痛中的傷害感受傳導，本研究試圖闡明在P2X2/3受體介導的三叉神經痛中，大黃素對痛覺傳遞的作用。

1 材料與方法

1.1 動物和分組 ♂ SD大鼠，220～250 g，40只，江西中醫學院實驗動物科學部提供，合格證號:JZDWN2:2011-0316。將大鼠隨機分為4組，每組10只。Ⅰ組為0.5%羧甲基纖維素鈉溶液注射對照組(Control)、Ⅱ組為假手術組(Sham)、Ⅲ組為三叉神經痛模型組(TN)、Ⅳ組為TN模型+大黃素干預組(TN+E)。Ⅰ組每天按5 ml·kg－1劑量腹腔注射0.5%的羧甲基纖維素鈉至實驗結束;Ⅱ組切開皮膚暴露眶下神經，不結扎神經，即縫合皮膚;Ⅳ組術后d 1開始每天每只大鼠腹腔注射50 mg·kg－1大黃素至實驗結束，大黃素用0.5%的羧甲基纖維素鈉溶解。

1.2 藥品和試劑 大黃素(南京澤朗醫藥科技有限公司)，10%水合氯醛(上海新亞藥業有限公司)，DAB顯色試劑盒(北京中山生物技術有限公司)，免疫組化SP-9001試劑盒(北京中山生物技術有限公司)，P2X2、P2X3原位雜交試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，P2X2、P2X3抗體(Millipore公司)，β-actin、P2X2、P2X3引物(北京生物工程有限公司)。

1.3 三叉神經痛模型的建立 參照文獻［12］10%水合氯醛按4 ml·kg－1劑量對大鼠進行腹腔內注射麻醉。大鼠麻醉后取俯臥位，頭部及四肢固定。備皮、消毒、鋪巾。在手術顯微鏡下做眉弓上弧形切口，顯露顱骨額骨和鼻骨，暴露眼眶，沿眶上緣將眶內容物用神經剝離子撥開，暴露位于眶底部內側的眶下神經，在眶內從近端仔細分離眶下神經至遠端的眶下孔。用兩根鉻腸線(5-0)間距約2 mm結扎眶下神經，力度適中。壓迫標準:在顯微鏡下可見結扎線使神經的直徑略微變細，但不能完全阻斷其傳導且神經外膜的血液循環必須通暢。縫合創口，待動物清醒后給予一般飼養。

1.4 三叉神經痛大鼠機械痛敏測定 將各組大鼠分別于手術前 1 d，術后 1、3、5、7、9、11、13 d 行機械痛敏閾值測試(測定時間恒定于每日10:00～14:00，室溫維持在22℃ ±0.5℃)。機械痛敏閾值是由BME-403 Von Frey細絲(購自中國醫學科學院生物醫學工程研究所)來測定，折力分別為:0.13、0.20、0.33、0.60、1.30、3.60、5.00、7.30、9.90、20.1 g，從最小折力開始，刺激部位為眶下神經在面部感覺支配區域—圍繞鼻區中央的觸須部位及周圍有毛皮膚。手持刺激棒緩慢接近大鼠，先在手術的對側刺激3下，使細絲彎曲，再在手術側刺激3下，每一強度的細絲共刺激6次。在此過程中，細絲的強度由低到高依次遞增。動物的陽性反應包括:①經刺激即表現為快速的后退動作，大鼠為避免面部進一步被接觸，倦縮身子向籠壁靠攏，或將頭面部藏在身下，躲避刺激物。② 攻擊行為，大鼠亦可表現出快速抓咬刺激物，做出攻擊動作。③非對稱性的面部搔抓，表現為至少連續3次搔抓面部刺激區域的動作，通常合并后退動作。出現以上3種反應中任意1項或l項以上即認為是刺激實驗陽性，使大鼠產生陽性反應細絲強度最小值即為疼痛反應閾值。④如果刺激強度為20.1 g時，大鼠未出現以上任何一種反應，疼痛閾值定為20.1 g。觀察各組大鼠手術前后對于不同強度細絲刺激產生痛覺反應闞值的變化，與對照組比較，進行統計學分析。

1.5 大鼠三叉神經節P2X2/3受體的表達測定

1.5.1 原位雜交 大鼠迅速斷頭，取手術側TG，原位雜交用PBS沖洗后用原位雜交用4%多聚甲醛固定24 h，然后浸入原位雜交用30%蔗糖脫水24 h，期間換糖水3次，4℃冰箱過夜。恒冷切片機將TG切成15 μm厚的薄片，烤片37℃，2 h，－20℃保存。原位雜交過程按說明書完成。顯微鏡下拍照，實驗結果用Image tool圖像分析系統觀察分析光密度。

1.5.2 RT-PCR 按說明書完成總RNA的提取和cDNA的合成。本研究選用β-actin作為內參，引物序列如下:

Primer P2X2(產物長度為273 bp)，S:5'-CTGCCTCCTCAGGCTACAACTTCA-3';A:5'-GAGTACGCACCTTGTCGAACTTCT-3'。Primer P2X3(產物長度為 519 bp)，S:5'-CAACTTCAGGTTTGCCAAA-3';A:5'-TGAACAGTGAGGGCCTAGAT-3'。Primer β-actin(產物長度為240 bp)，S:5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3';A:5'-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3'。

P2X2、P2X3和 β-actin擴增體系分別如下:DEPC 水 9.5 μl，cDNA 1 μl，上下游引物各 1 μl，2 ×Taq酶12.5 μl。PCR 反應條件:94℃ 3 min;94℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 45 s，共 35 個循環;72℃ 5 min。各組取5 μl擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果、拍照，采用凝膠成像系統讀取分析目的電泳條帶，以各組β-actin為內參將其相應組P2X2、P2X3的灰度值標化后進行比較。

1.5.3 免疫組織化學 大鼠迅速斷頭，取手術側TG，用PBS沖洗后，4%多聚甲醛固定24 h，然后將組織浸入30%蔗糖脫水24 h，中途換糖水3次，4℃冰箱過夜。恒冷切片機將TG切成15 μm厚的薄片，烤片37℃，2 h，－20℃保存。二步法免疫組織化學染色，DAB顯色。顯微鏡下拍照，用Image tool圖像分析系統觀察分析光密度。

1.5.4 免疫熒光 前期準備同免疫組化，免疫熒光過程按說明書完成。熒光顯微鏡下拍照，實驗結果用Image tool圖像分析系統觀察分析光密度。

1.5.5 Western blot 將手術側大鼠TG置于2 ml勻漿器中球狀部位，加300 μl去污劑裂解液(含10%PMSF)于勻漿器中進行冰上勻漿，充分裂解后移至1.5 ml離心管中，以12 000 r·min－1于 4℃ 離心5 min，取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于－20℃保存。SDS-PAGE電泳，轉膜，免疫學檢測，光密度分析。通過Image tool圖像分析軟件讀取目的條帶在X光膠片上測得的光密度掃描值，以各組β-actin條帶的掃描值標化其相應組P2X2、P2X3的蛋白表達量。

1.6 統計學分析 實驗數據用SPSS11.5統計軟件進行統計分析，各實驗組數據均以±s表示，各組數據間的統計采用方差分析。

2 結果

2.1 大鼠機械痛敏閾值測定 手術前Ⅰ組(Control組)、Ⅱ組(Sham組)、Ⅲ組(TN組)、Ⅳ組(TN+E)之間相比大鼠手術側眶下神經面部感覺區域機械痛閾值差異沒有顯著性(P＞0.05)。術后2周內，Ⅲ組(TN模型組)的機械痛反射閾值在雙側都有所下降，手術側下降更為明顯。術后d 1開始，Ⅲ組的手術側機械痛反射閾值與Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組比較降低(P＜0.01)，并從術后d 3開始明顯并一直持續到14 d(P＜0.01)。從術后d 1開始，Ⅳ組的手術側機械痛反射閾值和Ⅰ、Ⅱ組比較有所降低(P＜0.01)，從d 11開始無差異，但從術后d 5開始與Ⅲ組比較明顯增加(P＜0.05)，見Fig 1。

Fig 1 Effect of emodin on the mechanical withdrawal threshold of TN rats(n=10)

Average optical density of P2X3mRNA in the four groups(n=10).##P ＜0.01 vs TN.(arrows indicated the immunostaining neurons;scale bars，100 μm)

Fig 2B Effects of emodin on the expression of P2X2receptor mRNA in trigeminal ganglion of each group by in situ hybridization on postoperative d 14

2.2 大鼠TG中P2X2/3受體表達的測定

2.2.1 原位雜交 術后14 d，原位雜交測定大鼠TG切片中P2X2/3受體mRNA的表達。于每只大鼠TG切片中隔5張取1張切片，用圖像分析系統軟件分析P2X2/3陽性神經元的光密度變化。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組P2X3陽性神經元的平均光密度分別為:0.2311±0.0204、0.2355 ±0.0216、0.5801 ±0.0422、0.3233±0.035。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組P2X2陽性神經元的平均光密度分別為:0.2551±0.0236、0.2678 ± 0.0253、0.5676 ± 0.0463、0.2933±0.0315。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組之間P2X2/3受體表達差異無顯著性(P＞0.05);Ⅲ組TG中P2X2/3受體的表達較Ⅰ組、Ⅱ組明顯增加(P＜0.01);Ⅳ組TG中P2X2/3受體的表達較Ⅲ組低(P＜0.01)，見Fig 2。

2.2.2 RT-PCR 術后14 d，PCR方法測定各組三叉神經節中P2X2/3受體mRNA的表達。經凝膠成像系統軟件分析后，以β-actin為內參將P2X3的灰度值進行標化，結果如下:Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組分別為:0.3081 ±0.0162、0.3111 ±0.0110、0.4979 ±0.0271、0.3359 ±0.0125。以β-actin為內參將P2X2的灰度值進行標化，結果如下:0.3055±0.0167、0.3150±0.0132、0.6266 ±0.0199、0.3445 ±0.0131。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組之間P2X2/3受體表達差異無顯著性(P＞0.05);Ⅲ組TG中P2X2/3受體的表達較Ⅰ組、Ⅱ組明顯增加(P＜0.01);Ⅳ組 TG中P2X2/3受體的表達較Ⅲ組低(P＜0.01)，見Fig 3。

Fig 3 Effects of emodin on the expression of P2X3receptor mRNA in TG of each group by RT-PCR on postoperative d 14(n=10)

2.2.3 免疫組織化學 術后14 d，免疫組化測定大鼠TG切片中P2X2/3受體的表達。于每只大鼠TG切片中隔5張取1張切片，用圖像分析系統軟件分析P2X2/3陽性神經元的光密度變化。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組P2X3陽性神經元的平均光密度分別為:0.1668±0.0246、0.1702 ±0.0197、0.3290 ±0.0283、0.1847±0.0210。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組P2X2陽性神經元的平均光密度分別為:0.1549±0.0183、0.1657 ± 0.0143、0.3548 ± 0.0243、0.1808±0.0228。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組之間P2X2/3受體表達差異無顯著性(P＞0.05);Ⅲ組TG中P2X2/3受體的表達較Ⅰ組、Ⅱ組明顯增加(P＜0.01);Ⅳ組TG中P2X2/3受體的表達較Ⅲ組低(P＜0.01)，見Fig 4。

Fig 4A Effects of emodin on the expression of P2X3receptor protein in TG of each group by immunohistochemistry on postoperative d 14(n=10)

Fig 4B Effects of emodin on the expression of P2X2receptor protein in trigeminal ganglion of each group by immunohistochemistry on postoperative d 14(n=10)

2.2.4 免疫熒光 術后14 d，免疫熒光雙標測定大鼠TG切片中P2X3、P2X2受體的表達。結果顯示，P2X3和P2X2共同表達于三叉神經節神經元細胞上，且Ⅲ組TG中P2X2/3受體的表達較Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組增加，見Fig 5。

2.2.5 蛋白印跡 術后14 d，Western blot方法測定各組三叉神經節中P2X2/3受體蛋白的表達。經凝膠成像系統軟件分析后，以β-actin為內參將P2X3的光密度值進行標化，結果如下:Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組分別為:0.1523±0.0163、0.1632±0.0184、0.6666±0.0482、0.2319±0.0284。以 β-actin為內參將P2X2的光密度值進行標化，結果如下:0.1879± 0.0174、0.1893 ± 0.0187、0.5362 ± 0.0429、0.3246±0.0262。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組之間P2X2/3受體表達差異無顯著性(P＞0.05);Ⅲ組TG中P2X2/3受體的表達較Ⅰ組、Ⅱ組明顯增加(P＜0.01);Ⅳ組TG中P2X2/3受體的表達較Ⅲ組低(P＜0.01)，見Fig 6。

Fig 5 Colocation of P2X2and P2X3in TG by double-label immunofluorescence on postoperative d 14

3 討論

嘌呤受體分為P1和P2受體，ATP及其類似物作用于P2受體。P2受體分為配體門控性離子通道型受體(P2X受體)和G蛋白偶聯型受體(P2Y受體)［13］。大量研究顯示嘌呤受體中的P2X2/3受體參與疼痛的發病過程［14－16］。三叉神經節中含有大量與外周痛覺傳導有關的中小型神經細胞，并有P2X2/3受體的表達［17］，但目前 P2X2/3受體在三叉神經痛的痛覺傳導過程中所起的作用還不是很清楚。

本實驗應用大鼠三叉神經痛模型研究發現，術后d 1開始，TN模型組的機械痛敏閾值降低，并從術后d 3開始更為明顯并一直持續到d 14。應用RT-PCR和原位雜交技術檢測TN大鼠手術側TG中P2X2/3受體mRNA的表達，結果顯示TN模型大鼠TG中P2X2/3受體mRNA的表達明顯升高，免疫組化和蛋白印跡技術檢測大鼠手術側TG中P2X2/3受體蛋白的表達，結果與其在mRNA水平的表達也基本一致。這些結果提示，P2X2/3受體蛋白和 mRNA的表達異常與三叉神經痛密切相關。我們推測與外周痛覺傳遞有關的TG神經元可能是通過激動P2X2/3受體，參與痛覺的調制。慢性壓迫損傷眶下神經造成的三叉神經節P2X2/3受體免疫反應陽性數量增加，有可能是由于在神經損傷位點，異位嘌呤能神經敏感性增強，從而導致P2X受體上調所致。

Fig 6A Effects of emodin on the expression of P2X3receptor protein in TG of each group by Western blot on postoperative d 14(n=10)

Fig 6B Effects of emodin on the expression of P2X2receptor protein in trigeminal ganglion of each group by Western blot on postoperative d 14(n=10)

近年大量研究顯示嘌呤受體中的P2受體是參與痛覺傳遞的重要受體［18－19］，嘌呤受體可能成為疼痛治療的新靶點［20］。我們實驗室以往的實驗也顯示能特異性拮抗P2X3受體的川芎嗪、阿魏酸鈉等藥物對坐骨神經壓迫損傷神經病理痛大鼠的機械性痛覺異常和熱痛覺過敏有一定的緩解作用［21－22］。本實驗我們采用大黃素進行干預治療后發現，大黃素能明顯提高TN大鼠的機械痛敏閾值，而且從術后d 5開始明顯增加，于術后d 11開始和對照組差異無顯著性。這些結果表明大黃素對TN大鼠的機械痛敏具有一定的抑制作用，可以緩解TN大鼠神經病理痛的行為學表現。用大黃素對TN大鼠進行治療后，RT-PCR和原位雜交技術檢測結果表明TN大鼠手術側TG中升高的P2X2/3受體mRNA表達有明顯下降，免疫組化和蛋白印跡技術檢測結果也表明大鼠手術側TG中P2X2/3受體蛋白的表達也有明顯下降。因此提示大黃素可能是通過抑制P2X2/3受體表達上調而對三叉神經痛大鼠的機械痛敏發揮抑制作用，大黃素對P2X2/3受體介導的三叉神經痛具有一定抑制作用。

總之，TN是一個非常復雜的病理過程，對原發性三叉神經痛迄今為止還沒有一個確切的病因解釋，也沒有特別有效且副作用比較小的藥物治療，有必要進一步研究該病的分子機制，以便尋找新的治療方法。本研究表明P2X2/3受體涉及到TN大鼠的疼痛傳遞過程，大黃素可以降低TN大鼠 TG中P2X2/3受體的表達，抑制TN大鼠的機械痛敏，提示大黃素有可能成為TN治療的新的靶點藥物，促進TN的治療發展。

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