TF3-H4對CD4+CD25+調節性T細胞和CD4+CD25－效應性T細胞早期活化的影響

李曉娟，胡義平，劉 燕，姜志宏，劉叔文

(1.南方醫科大學藥學院，廣東廣州 510515;2.澳門科技大學中藥質量控制國家重點實驗室，澳門)

茶黃素是從茶葉中提取的一類苯駢酚酮的衍生物，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等多種藥理作用［1－3］。茶黃素-3，3'-雙沒食子酸酯(theaflavin-3，3'-digallate，TF3)是茶黃素的主要活性成分，本實驗室針對其水溶性低、穩定性差等缺點，將其加氫還原改善后，獲得了新化合物 1'，2'，3'，7'-四氫茶黃素-3，3'-雙沒食子酸酯(1'，2'，3'，7'-4H-theaflavin-3，3'-digallate，TF3-H4)［4］。根據 CD4+T 細胞表面 分 子CD25表達的不同，可將其分為CD4+CD25－效應性T細胞(Teff)和CD4+CD25+T調節性細胞(Treg)功能不同的兩群細胞。二者均可經由抗原、通過TCR的信號通路被活化，但活化后前者促進免疫炎癥反應，后者可抑制免疫反應和維持機體的耐受，表現出不同的功能和作用［5－6，12］。觀察 TF3-H4 經由TCR通路對兩群不同的CD4+T細胞的活化的影響，可從免疫角度探討茶黃素發揮抗炎、抗腫瘤等作用的可能機制。本實驗通過觀察TF3-H4對兩種CD4+T細胞亞群的活化標志CD69表達的影響，初步探索茶黃素衍生物對Teff或 Treg占優勢疾病的可能治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級BALB/c近交系小鼠(♀，6～8周齡)購自南方醫科大學實驗動物中心。ConA購自美國Sigma公司。RPMI 1640培養基、胎牛血清和β-二巰基乙醇購自美國Gibco公司。羧基熒光素雙醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFDA-SE)購自美國Invitrogen Molecular Probes公司。小鼠FITC-抗CD69單抗、FITC-抗 CD4單抗、CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞檢測試劑盒購自美國eBioscience公司。CD4+CD25+調節性T細胞MACS磁珠分離試劑盒購自德國美天旎公司。流式細胞儀為美國BDPharMingen公司的FACSCalibur。

1.2 方法

1.2.1 TF3-H4制備 TF3-H4為淡黃色固體，是在保留茶黃素-3，3'-雙沒食子酸酯(深褐色)原有結構中的苯環及酚羥基基團的基礎上，對其苯駢酚酮結構中的七元酚酮環進行碳環氫化還原制備而成(具體步驟省略)。

1.2.2 CD4+CD25+T 細胞和 CD4+CD25－T 細胞的分離和檢測 分離BALB/c小鼠脾臟細胞，過400目網。按MACS磁珠分離試劑盒推薦的步驟，用一系列生物素化的抗體混合物和抗生物素微珠間接磁性標記非CD4+T細胞，標記的非CD4+T細胞滯留在分選柱上，未標記的CD4+T細胞通過分選柱流出而預富集CD4+T細胞。后用抗PE磁性微珠標記富集 CD4+T細胞中 CD25－PE標記的細胞，將CD4+CD25+調節性T細胞滯留在分選柱上，收集流出未標記CD25－PE的CD4+CD25－T細胞。為獲得更高純度的CD4+CD25+T細胞，將分選柱移出磁場，CD4+CD25+T細胞作為陽性成分洗脫之后再過一個新的分選柱，從而獲得高純度的CD4+CD25+調節性T細胞。磁珠分選的細胞加抗小鼠CD4-FITC單抗標記15 min，流式細胞儀檢測 CD4+CD25－和CD4+CD25+T細胞純度。磁珠分離前小鼠脾臟CD4+CD25+細胞的Foxp3檢測按照小鼠調節性T細胞試劑盒(eBioscience)檢測說明書進行。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞表面早期活化標志CD69的表達 采用直接免疫熒光標記法進行檢測。細胞按2～4×105/孔加入96孔板，檢測TF3-H4對ConA和PDB刺激的CD4+CD25－T細胞CD69的表達的影響。實驗設5組:正常組，ConA(2 mg·L－1)組，ConA(2 mg·L－1)+TF3-H4(20 mg·L－1)組，PDB(2× 10－7mol·L－1)組，PDB(2× 10－7mol·L－1)+TF3-H4(20 mg·L－1)組。來源于細胞膜的信號能很好地激活Treg細胞的免疫抑制功能，因此觀察TF3-H4對ConA而不是PDB刺激后CD4+CD25+T細胞CD69的表達的影響。細胞按2×105/孔加入96孔板，實驗設3組:正常組，ConA(2 mg·L－1)組，ConA(2 mg·L－1)+TF3-H4(20 mg·L－1)組。各組細胞培養12 h后，收取細胞，離心，PBS洗兩遍，濃縮至 100 μl，加入 0.5 μg/106FITC-抗 CD69單抗。混勻后，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌兩次后，重懸于200 μl的PBS中，立即用流式細胞儀進行檢測。

1.2.4 流式細胞儀檢測及分析 用 FACSCalibur流式細胞儀進行檢測，CellQuest軟件獲取數據。每個樣品檢測10 000個細胞，所得數據用CellQuest軟件分析。

2 結果

2.1 調節性T細胞和效應性T細胞純度的檢測磁珠分離前小鼠脾臟的細胞以CD4+CD25+雙陽性的細胞設門Gate 1(Fig 1A)，分析Foxp3的表達(Fig 1B)，表明CD4+CD25+天然調節性T細胞為高表達Foxp3陽性的細胞。細胞經分離純化后用流式細胞儀檢測，CD4+CD25+調節性T細胞的純度為91%(Fig 1C)，CD4+CD25－效應性T細胞的純度為90%(Fig 1D)。

Fig 1 The purity of CD4+CD25+regulatory T cells and CD4+CD25－effector T cells

2.2 TF3-H4對CD4+CD25－效應性T細胞早期活化標志CD69表達的影響 經2 mg·L－1ConA和 2×10－7mol·L－1PDB 作用 12 h 后，CD4+CD25－T細胞早期活化標志CD69表達均明顯升高(Fig 2)。TF3-H4對ConA刺激的CD4+CD25－T細胞早期活化標志CD69表達具有抑制作用，而對PDB刺激的CD4+CD25－T細胞早期活化標志CD69表達沒有抑制作用(Fig 2)。

2.3 TF3-H4對CD4+CD25+調節性T細胞早期活化標志CD69表達的影響 經2 mg·L－1ConA作用12 h后，CD4+CD25+T細胞早期活化標志CD69表達明顯升高。TF3-H4對 ConA刺激的CD4+CD25+T細胞早期活化標志CD69表達有明顯的抑制作用(Fig 3)。

Fig 2 Effects of TF3-H4 on the early T cell activation marker CD69 expression in CD4+CD25－effector T cells after ConA or PDB stimulation

Fig 3 Effects of TF3-H4 on the early T cell activation marker CD69 expression in CD4+CD25+regulatory T cells after ConA stimulation

3 討論

茶黃素衍生物的抗炎、抗腫瘤作用可能與其調節T細胞的功能、影響機體的免疫狀態有關。為此，研究藥性更好的新茶黃素衍生物TF3-H4對T細胞的調節作用具有重要意義。CD69是T細胞通過T細胞受體(TCR)信號通路活化的一個早期信號分子，在抗原激活后的Teff、Treg兩群細胞上的表達均明顯增加［7］。CD69分子在靜息細胞的膜表面低水平表達，但在抗原、多克隆刺激劑等作用下表達迅速增強，具有很高的敏感性［9］。ConA和PDB可以部分模擬抗原的作用，分別通過細胞膜上的CD3-TCR復合體和下游的PKC激酶活化效應性CD4+T細胞。此外本實驗室還觀察到ConA能激活Treg細胞CD69的表達，并在體外促進Treg的免疫抑制功能［8］。在絲裂原 ConA或 PDB的作用下，CD4+CD25－Teff細胞的 CD69表達均可明顯升高。但TF3-H4不抑制PDB激活的Teff細胞CD69的表達，卻能抑制ConA激活的Teff細胞CD69表達。由于ConA作用于T細胞膜上的CD3-TCR復合體、PDB作用于下游PKC激酶，二者通過不同的作用部位激活T細胞，所以TF3-H4可能主要通過作用于上游的TCR發揮對Teff的早期活化的抑制作用。

而來源于細胞膜TCR的信號能夠很好地激活與Teff功能相反的Treg細胞活化及其免疫抑制功能。以往研究發現［8］，ConA在Teff與Treg共培養體系中表現為促進Treg的免疫抑制功能。本實驗用ConA激活Treg，發現20 mg·L－1的TF3-H4能抑制ConA激活的Treg細胞的CD69表達。因此，TF3-H4可能也將降低Treg的免疫抑制功能，尤其是在Treg占優勢的情況下。TF3-H4對Teff、Treg兩群功能相反的細胞早期活化均表現出抑制作用，提示其在兩群細胞活化不同的疾病狀態，如腫瘤和炎癥，可能發揮不同的作用。在類風濕性關節炎等自身免疫性疾病中，效應性T細胞的過度活化是造成免疫損傷的重要因素之一［10－11］。TF3-H4抑制Teff經TCR途徑的免疫活化，可降低Teff的殺傷活性，起抗炎作用，減輕免疫損傷。而在Treg細胞明顯增加的腫瘤組織中［6］，TF3-H4抑制 Treg活化，可促進 Teff功能，發揮抗腫瘤作用。

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