苦參堿調控環氧化酶-2的表達及對大鼠膀胱癌抑制作用的初步研究

鄧 寧，高 華，，國亞芳，邱曉峰，馮 軍，鄭 萍，戴貴東，3

(1.寧夏醫科大學藥學院，2.寧夏醫科大學總醫院，3.寧夏回藥現代化工程技術研究中心，寧夏銀川 750004)

苦參堿(matrine)是從寧夏特色回藥材豆科槐屬植物苦豆子(Sophore alopecuroidesL)中提取的生物堿之一，具有抗炎、抗心律失常、抗乙肝病毒和抗腫瘤等多種藥理作用［1－4］，對肺癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞的增殖具有明顯的抑制作用，并可誘導其分化或(和)凋亡［4－6］。本研究旨在通過大鼠膀胱癌模型的建立，重點觀察苦參堿對膀胱癌的抑制作用及對膀胱組織中COX-2表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級♂ Sprague-Dawley大鼠，7～8

周齡，體質量120～160 g，由寧夏醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK(寧)2009-0003。

1.2 藥品與試劑 苦參堿購自寧夏紫荊花藥業股份有限公司，純度＞99.0%，批號:P0100226。塞來昔布(celecoxib)購自武漢嘉凱隆科技發展有限公司，純度 ＞99.5%，批號:20081116。N-丁基-N-(4-羥丁基)亞硝基胺(BBN)購自日本東京化成工業株式會社，其原液呈棕黃色，油狀透明，4℃冰箱貯存，臨用時以乙醇/水(乙醇∶水=20∶80)配制成BBN混懸溶液使用。COX-2免疫組織化學檢測試劑盒以及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 給藥方法及分組 大鼠隨機分為6組，分別是空白對照組(Control)、BBN組、塞來昔布(500 mg·kg－1)組和苦參堿(50、100、200 mg·kg－1)組。除空白對照組給予等體積溶劑對照溶液外，其余各組灌胃給予膀胱癌致癌劑BBN按每只200 mg/0.5 ml，每周2次，連續8周。塞來昔布組和苦參堿組在給予BBN前1周開始，空白對照組和BBN組給予等容量NS，均采用灌胃方式給藥，每日1次，連續35周。各組動物于35周后處死。實驗過程中，由于灌胃操作引起肺、胃損傷及其他不明原因造成死亡的大鼠被排除在統計分析之外。

1.4 膀胱組織病理 全部實驗大鼠于35周稱重后處死，剝離膀胱并稱量其重量，計數各組膀胱重量＞200 mg的個數以判斷腫瘤的生長情況［7］。用10%中性福爾馬林固定24 h后石蠟包埋，切片厚4 μm，行常規HE染色后，鏡檢觀察、分析。

1.5 大鼠膀胱COX-2蛋白表達的檢測 石蠟包埋的膀胱組織切片厚4 μm，按照SP免疫組化試劑盒說明書操作，其中所用COX-2一抗濃度為1∶100。設PBS代替一抗的陰性對照，COX-2蛋白的陽性表達為胞質染成棕黃色顆粒。由兩位病理醫師分別獨立對實驗結果進行雙盲法評估。每一切片隨機選擇5個視野(×100)，在顯微鏡(×400)下計數100個細胞，取5個視野的平均百分數為判定結果。以細胞染色強度和細胞陽性百分率進行計分。根據陽性細胞比例評分:＜20%計0分，20% ～50%記1分，51%～80%記2分，＞80%記3分;根據染色強度評分:無染色為0分，淡黃色為1分，中等強度黃色為2分，出現棕黃色顆粒為3分。將陽性細胞比例評分和染色強度評分相加即COX-2蛋白表達評分。

1.6 統計學方法 實驗結果采用SPSS 11.5統計軟件包進行分析，數據以±s表示，多組間均數的差異性比較采用One-way ANOVA分析;率的比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法進行分析。

Tab 1Effects of matrine on body weight and bladder weight in rats induced by BBN(±s)

Tab 1Effects of matrine on body weight and bladder weight in rats induced by BBN(±s)

＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs BBN group

Group Body weight/g Initial Final Weight gain No.Bladder Wt Greater Than 200 mg/Total No./%Control 158.7 ±27.4 568.7 ±55.3 410.0 ±70.1 (0/15)0 BBN 164.3 ±33.3 551.3 ±56.3 386.9 ±65.9 (20/20)100＊＊Celecoxib+BBN 157.6 ±27.3 551.0 ±59.8 393.4 ±59.5 (5/8)62.5＊＊#Matrine 50 mg·kg－1+BBN 144.6 ±36.6 471.7 ±54.9＊＊## 327.1 ±44.9＊＊## (13/19)68.4＊＊##Matrine 100 mg·kg－1+BBN 154.7 ±28.7 485.9 ±29.8＊＊## 331.2 ±37.1＊＊## (15/19)78.9＊＊#Matrine 200 mg·kg－1+BBN 172.0 ±26.1 444.6 ±40.3＊＊## 272.6 ±50.4＊＊## (5/8)62.5＊＊#

Tab 2 Histopathological diagnosis on bladder in rats*

2 結果

2.1 苦參堿對大鼠體質量和膀胱的影響 各組大鼠初始體質量差異無統計學意義，與空白對照組及BBN組比較，苦參堿各劑量組終末體質量及體質量增長量均明顯下降(P＜0.01)。空白對照組膀胱重約140 mg，其他各組膀胱重量明顯增加(P＜0.01);與 BBN 組相比，苦參堿(50、100、200 mg·kg－1)組膀胱重量＞200 mg的比例明顯下降(P＜0.01，P＜0.05)，見Tab 1。形成的腫瘤，有的突入(出)膀胱腔，呈菜花狀，有的潰瘍伴出血壞死(Fig 1)。

2.2 苦參堿對大鼠膀胱腫瘤的影響 光鏡可見癌變的移行上皮細胞異型性明顯，乳頭狀生長，細胞層次增多，表現為細胞大小不一，排列紊亂，極向消失，核大，形態不一，核畸形，核漿比例大，可見病理性核分裂象，部分標本可見癌細胞侵犯粘膜固有層及肌層(Fig 2)。89只大鼠膀胱組織樣本經HE染色病理分析，膀胱尿路上皮癌的發生率BBN組為70%(14/20)，塞來昔布組為25%(2/8)，苦參堿(50、100和 200 mg·kg－1)組分別為 68.4%(13/19)、57.9%(11/19)、37.5%(3/8)。與 BBN組相比，除塞來昔布組癌變率明顯降低(P＜0.05)外，苦參堿各劑量組癌變率差異無統計學意義(P＞0.05)。在確診的膀胱尿路上皮癌中，苦參堿(50、100 mg·kg－1)組浸潤性膀胱尿路上皮癌的發生率分別為15.4%(2/13)和9%(1/11)，較 BBN［50%(7/14)］組明顯降低(P＜0.05)，見Tab 2。

2.3 苦參堿對大鼠膀胱COX-2蛋白表達的影響COX-2蛋白陽性產物主要定位于細胞質中，呈棕黃色灶性或彌漫性分布。苦參堿(50、100和200 mg·kg－1)組大鼠膀胱COX-2蛋白的陽性表達率較BBN組明顯降低(P＜0.05)，見 Fig 3，Tab 3。

Fig 1 Bladder tissue in rats

3 討論

BBN以其代謝產物N-丁基-N-(3-羧丙基)亞硝基胺(BCPN)自尿液中排泄，直接接觸尿路上皮，并損傷上皮細胞DNA，而致細胞癌變。因BBN所誘發膀胱腫瘤為多發性，以上皮癌為主，與人類膀胱癌的組織學相似，而成為膀胱癌藥物篩選和作用機制研究的經典動物模型。文獻報道BBN所致膀胱癌的發生率為 55% ～85%［12，14］，本實驗 BBN 組癌變率為70%，與文獻報道相一致。

Fig 2 Hematoxylin-eosin staining in bladder tissue of rats(×200)A:Control group;B:BBN group

Tab 3Expression index of COX-2 in bladder of rats(±s)

Tab 3Expression index of COX-2 in bladder of rats(±s)

＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs BBN group;▲P＜0.05 vs Celecoxib group

Group n COX-2 protein index Control 15 0.87 ±0.83#▲BBN 20 3.70 ±1.17＊＊▲Celecoxib+BBN 8 2.25 ±1.04＊＊#Matrine 50 mg·kg－1+BBN 19 2.95 ±0.78＊＊#Matrine 100 mg·kg－1+BBN 19 2.58 ±0.96＊＊#Matrine 200 mg·kg－1+BBN 8 2.88 ±0.64＊＊#

苦參堿具有抗腫瘤作用，可誘導肝癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞的分化或(和)凋亡，但以往的研究以體外實驗為主，未見有關苦參堿對膀胱癌的體內實驗研究，為此，本實驗以BBN誘發大鼠膀胱癌為模型，初步研究了苦參堿對膀胱癌的抑制作用及其機制。研究結果表明，苦參堿對BBN所誘發大鼠膀胱癌變率無影響，但可降低200 mg以上膀胱腫瘤的發生率和浸潤性膀胱尿路上皮癌的發生率，提示苦參堿對BBN誘導大鼠膀胱癌的發生無抑制作用，但對膀胱腫瘤的生長和進展具有抑制作用。

Fig 3 Expression of COX-2 in bladder of rats

膀胱癌是泌尿系統常見的惡性腫瘤之一，其發生與吸煙、職業接觸和慢性炎癥反應等密切相關，其中慢性炎癥反應致膀胱癌的學說近年來倍受關注，慢性炎癥反應致膀胱上皮的增生及膀胱癌的發生與COX-2的異常表達及其介導的COX-2-mPGES信號轉導通路的異常有關［8－9］。研究表明［10－14］，膀胱癌COX-2表達增高，給予COX-2選擇性和非選擇性抑制劑如:阿司匹林、吡羅昔康、吲哚美辛、塞來昔布等均可明顯抑制膀胱癌的生長與轉移。由此可見，抑制COX-2的表達并影響其介導的效應，是研究抗膀胱癌藥物極為重要的作用靶點。本實驗結果發現，與BBN組比較，苦參堿(50、100和200 mg·kg－1)可明顯抑制大鼠膀胱COX-2蛋白的表達，提示苦參堿抑制膀胱癌進展的作用機制與其抑制COX-2的表達有關。

綜上所述，苦參堿對BBN誘導大鼠膀胱癌的發生無抑制作用，但對膀胱癌的生長和進展具有抑制作用，其機制與抑制大鼠膀胱組織中COX-2蛋白的表達有關。

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