黃芩莖葉總黃酮對高甘油三酯血清致人臍靜脈內皮細胞氧化損傷的保護作用及機制研究

王錦淳，蘇佩清，孫丹丹，俞 霞，周曉霞

(揚州大學醫學院生化教研室，江蘇揚州 225009)

近年來，國內外研究表明，高甘油三酯(high triglyceride，HTG)血癥是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)發生的獨立危險因素，而在高甘油三酯血清導致AS的過程中，由于活性氧(reactive oxygen species，ROS)增多引起的氧化應激所致的內皮細胞損傷可能起到了極其重要的作用。目前發現NADPH氧化酶(NADPH oxidase)是血管內生成ROS的主要酶體，內皮細胞主要表達 NADPH氧化酶家族(NOX)中的NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4，NOX4)［4］。

黃芩莖葉總黃酮 (Scutellaria baicalensis stemleaf total flavonoid，SSTF)為黃芩莖葉的提取物，其主要成分為黃酮類化合物，SSTF具有抗氧化、降血壓、抗菌、抑制平滑肌細胞的增殖及改善心腦血管的供血等廣泛的藥理活性［2－6］。本研究以體外培養的人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)為研究對象，旨在觀察SSTF對高甘油三酯血清致HUVEC氧化損傷的保護作用，以便為SSTF防治AS提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人臍靜脈內皮細胞株由南京醫科大學提供。

1.1.2 藥品 SSTF含量為61.8%(以總黃酮計)，由承德醫學院中藥研究所植化研究室提供，批號010408。SSTF粉末用0.1 mol·L－1NaOH 助溶后再加入DMEM溶液配制成相應濃度的SSTF DMEM溶液。

1.1.3 人正常血清與高甘油三酯血清 來源于蘇北人民醫院檢驗科健康體檢的正常人與單純高甘油三酯血癥患者的混合血清，混合后置于56℃水浴30 min滅活處理，并用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，全自動生化分析儀測得人高甘油三酯血清中總膽固醇(TC)含量為4.58 mmol、血糖(GLU)含量為4.60 mmol，均在正常范圍，而甘油三酯(TG)含量為3.26 mmol，高于正常范圍(0.55 ～1.82 mmol)。

1.1.4 主要試劑 新生牛血清(山東銀香偉業生物工程有限公司);DMEM干粉培養基(Gibco公司);超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、微量丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);活性氧(ROS)檢測試劑盒(江蘇碧云天生物技術研究所);TRlpure總RNA抽提試劑、逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司);NOX4、β-actin引物(上海生工生物工程有限公司合成);兔抗人NOX4抗體(英國Abcam公司);GAPDH抗體(美國AMRESCO公司)。

1.1.5 實驗儀器 二氧化碳培養箱(8000WJ，美國Thermo);超凈工作臺(SW-CJ-1F，蘇州凈化設備廠);倒置相差顯微鏡(XDS-1，重慶光學儀器廠);流式細胞儀(FACSAria，美國BD);PCR儀(9700，美國Gene);Mini-Protean Tetra電泳槽、Power Pac Basic蛋白垂直電泳儀(美國Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 人臍靜脈內皮細胞培養 將HUVEC細胞株培養于DMEM培養基(含體積分數為0.10的新生牛血清)中，置37℃、含體積分數為5%CO2的二氧化碳培養箱中常規培養。

1.2.2 實驗分組及處理 將HUVEC分為5組，每組設6個平行孔(n=6):①陰性對照組:5%人正常血清;② 模 型組:5%HTG;③ 低 濃度藥物組:5%HTG+SSTF 100 mg·L－1;④ 中 濃度藥物組:5%HTG+SSTF 200 mg·L－1;⑤ 高 濃度藥物組:5%HTG+SSTF 400 mg·L－1，于二氧化碳培養箱中下繼續培養16 h后進行相關指標的檢測。

1.2.3 SOD活性的測定 收集培養上清液，參照試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 MDA含量的測定 收集培養上清液，參照試劑盒說明書進行操作。

1.2.5 細胞內ROS的測定 去除細胞培養液，每孔加入稀釋好的DCFH-DA 1 ml，二氧化碳培養箱中孵育30 min(其中陽性對照組加陽性藥物Rosup 1 μl，常溫下孵育1 h)，收集細胞后，用流式細胞儀檢測各組細胞的熒光強度。將陰性對照組的熒光強度定為100%，其它各組的熒光強度用其相對于陰性對照組的百分比表示，應用CELL Quest TM軟件分析平均熒光強度。

1.2.6 半定量RT-PCR檢測NOX4的mRNA表達參照TRlpure試劑盒說明書提取各組細胞總RNA，按照逆轉錄試劑盒提供的實驗程序逆轉錄合成cDNA。PCR引物序列:β-actin:5'-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3'和5'-CTC-CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3'，擴增片段長度為539 bp;NOX4:5'-CAG GAG GGC TGC TGA AGT ATC AA-3'和5'-TGA CTG GCT TAT TGC TCC-GGA TA-3'，擴增片段長度為303 bp。PCR反應條件:94℃預變性5 min，94℃變性 3 0 s，58℃退火 3 0 s，72℃延伸 4 5 s，共 3 5個循環，72℃繼續延伸10 min。PCR產物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，電泳條帶用凝膠掃描儀觀察拍照，以β-actin擴增產物校正作光密度相對分析。

1.2.7 Western blot檢測 N OX4的蛋白表達 參照說明書加入RIPA裂解液和PMSF裂解細胞，提取各組細胞總蛋白。每組取100 μg總蛋白進行 S DSPAGE電泳，PVDF膜濕法電轉移100 min，室溫封閉2 h，用一抗(NOX4抗體)(TBST 1∶100稀釋)4℃孵育過夜，二抗 (TBST 1∶4 000稀釋)室溫孵育2 h，化學發光法(ECL)顯色并顯影、定影，膠片用掃描儀掃描，應用QuantityOne專業分析軟件半定量分析顯影帶。

2 結果

2.1SSTF對HTG致HUVEC氧化損傷SOD活性的影響 不同濃度的SSTF分別與HTG氧化損傷的HUVEC共同孵育16 h，測定培養液SOD活性，結果如Fig 1所示:與HTG組相比，各濃度組的SSTF都能明顯升高受損細胞的SOD活性(P＜0.05或P＜0.01)。

Fig 1 Effects of SSTF on SOD activity in HUVEC injury induced by HTG(±s，n=6)

2.2SSTF對HTG致HUVEC氧化損傷MDA含量的影響 不同濃度的SSTF分別與HTG氧化損傷的HUVEC共同孵育16 h，測定培養液MDA含量，結果如 Fig 2所示:與 HTG組相比，各濃度組的SSTF都能降低HUVEC的MDA含量(P＜0.01)。

2.3 SSTF對 HTG致HUVEC氧化損傷細胞內ROS水平的影響 未給予HTG刺激時，HUVEC內可以檢測到一定量的ROS，表明基礎狀態下細胞內也有ROS產生，給予5%HTG作用16 h后細胞內ROS水平明顯增加，與Control組相比，差異有統計學意義(P＜0.01)。不同濃度的SSTF分別與 HTG氧化損傷的HUVEC共同孵育16 h后測定細胞內ROS水平，結果如Fig 3所示:與HTG組相比，各濃度組的SSTF都能明顯減少受損細胞內ROS的生成(P＜0.01)。

Fig 2 Effects of SSTF on MDA content in HUVEC injury induced by HTG(±s，n=6)

Fig 3 Effects of SSTF on intracellular ROS level in HUVEC oxidative injury induced by HTG(±s，n=6)

2.4SSTF對HTG致HUVEC氧化損傷的NOX4 mRNA表達的影響 未給予HTG刺激的HUVEC內有NOX4 mRNA表達，給予HTG刺激后細胞內NOX4 mRNA表達明顯增加，與Control組相比，差異有統計學意義(P＜0.01)。不同濃度的SSTF分別與HTG氧化損傷的HUVEC共同孵育16 h，通過RT-PCR法檢測NOX4 mRNA表達，結果如Fig 4所示:與HTG組相比，各濃度組的SSTF均能明顯下調受損細胞的NOX4 mRNA表達(P＜0.01)。

2.5SSTF對HTG致HUVEC氧化損傷的NOX4蛋白表達的影響 未給予HTG刺激的HUVEC內有NOX4 mRNA表達，給予HTG刺激后細胞內NOX4 mRNA表達明顯增加，與Control組相比，差異有統計學意義(P＜0.01)。不同濃度的SSTF分別與HTG氧化損傷的HUVEC共同孵育16 h，通過Western blot法檢測NOX4蛋白表達，結果如Fig 5所示:與HTG組相比，各濃度組的SSTF均能明顯下調受損細胞的NOX4蛋白表達(P＜0.01)。

Fig 4 Effects of SSTF on NOX4 mRNA expression in HUVEC oxidative injury induced by HTG(±s，n=6)

3 討論

動脈粥樣硬化(AS)已經成為嚴重威脅人類健康的常見疾病。內皮細胞損傷是AS發生的始動環節，而高甘油三酯血癥是AS發生的獨立危險因素。在AS的發生發展中，氧化應激起主要作用［6］。研究表明，細胞內產生的ROS是調節血管結構和功能狀態的重要分子，但ROS過多卻是AS的重要危險因子之一［7］。在病理條件下，過多的ROS可以通過增加鈣離子水平來激活胞內信號通路和改變細胞內蛋白的氧化還原狀態，使脂質過氧化、黏附分子表達、基質金屬蛋白酶激活、內皮細胞功能失調、平滑肌細胞增殖和遷移以及血管收縮性改變，最終導致AS的發生與發展［8］，這是體內氧化和抗氧化失衡的結果。本實驗研究發現，5%的HTG作用16 h，可引起HUVEC的SOD活性明顯降低，MDA含量明顯增加。未給予HTG刺激時，HUVEC內可以檢測到一定量的ROS，表明基礎狀態下細胞內也有ROS產生;而給予5%HTG刺激16 h后細胞內ROS水平明顯增加。由此可見，HTG可通過降低SOD活性、增加MDA含量以及促進HUVEC內ROS生成誘導HUVEC氧化損傷。

Fig 5 Effects of SSTF on NOX4 protein expression in HUVEC oxidative injury induced by HTG(±s，n=6)

黃芩為多年生唇形科草本植物，藥用其根，是清熱燥濕，瀉火解毒的傳統中藥。SSTF為黃芩莖葉的提取物，是黃芩莖葉的有效部位，其主要成分為黃酮類化合物。多數黃酮類化合物具有抗氧化作用，黃酮類化合物是繼維生素E、維生素C和胡蘿卜素外的另一類天然強氧化劑［9］，其藥理作用早已被證實。多數黃酮類化合物對內皮細胞氧化損傷具有保護作用。史立宏等［10］研究發現，銀杏黃酮苷可能通過增加HUVEC內皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表達增加N0的釋放、抑制人可溶性細胞間黏附分子(ICAM-1)的表達等機制對內皮細胞起保護作用。陳徹等［11］研究發現，紅芪總黃酮可明顯降低 ox-LDL損傷HUVEC的LDH釋放，升高NO含量，提高細胞內SOD及NOS活性，對ox-LDL誘導的HUVEC氧化損傷具有保護作用。裴志芳等［12］研究發現，淫羊藿總黃酮可降低LPC誘導的內皮細胞上清液中MDA、LDH含量及細胞內ROS水平，增加NO含量，提示淫羊藿總黃酮對LPC誘導的血管內皮細胞損傷具有保護作用，其機制與降低細胞內ROS水平有關。本實驗結果表明，SSTF各濃度組均明顯提高受損細胞SOD活性(P＜0.05或P＜0.01)，明顯降低MDA含量，減少 HUVEC內 ROS的生成(P＜0.01)，提示SSTF可能通過增強抗氧化酶活性、抑制脂質過氧化效應以及抑制HUVEC內ROS的生成來發揮其抗氧化作用。

NADPH氧化酶目前被認為是血管內生成ROS的主要酶體，近來研究表明，NOX4是內皮細胞NADPH氧化酶的主要表現形式。Ago等［13］發現在HUVEC中主要表達NOX4 mRNA，用反義核酸技術抑制NOX4的表達能明顯地降低內皮細胞中活性氧的生成。Park等［14］的研究證實NOX4來源的ROS在脂多糖誘發的內皮細胞炎癥反應過程中起主要作用，抑制NOX4后細胞內ROS明顯減少。Wingler等［15］研究發現，在腎素－血管緊張素系統活性高表達的轉基因♂大鼠的主動脈和腎臟中NOX4 mRNA和NOX4蛋白水平較野生大鼠明顯增高，由NOX4介導的ROS生成增多。屈順林等［16－18］研究發現，HUVEC中ROS的產生主要源于NOX4，在高葡萄糖、高LDL和高血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)培養條件下，內皮細胞中NOX4 mRNA水平升高，同時細胞內活性氧生成和凋亡增加。因此，HTG可能通過NADPH氧化酶途徑刺激生成過多的ROS，進而誘導細胞氧化損傷。而SSTF的抗氧化機制，可能通過抑制NADPH氧化酶表達進而減少ROS的生成來發揮它的抗氧化作用。本實驗采用不同濃度的SSTF分別與HTG氧化損傷的HUVEC共同孵育，觀察ROS生成和NOX4表達的變化。實驗結果顯示，不同濃度的SSTF分別與HTG氧化損傷的HUVEC共同孵育16 h，與模型組相比，各濃度組的SSTF均能明顯下調受損細胞的NOX4 mRNA表達和蛋白表達(P＜0.01)。實驗結果表明，SSTF能夠抑制HTG氧化損傷的HUVEC內ROS生成和 NOX4表達，提示SSTF可能通過抑制NADPH氧化酶表達進而減少ROS的生成來發揮它的抗氧化作用。我們的研究結果為SSTF的抗氧化研究以及SSTF防治AS提供了一個新的實驗依據，但其更為確切的機制研究如SSTF如何調控NADPH氧化酶的表達、如何激活NADPH氧化酶以及SSTF作用的信號轉導通路等還有待進一步的探討。

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