針刺對海洛因成癮戒斷大鼠下丘腦－垂體－腎上腺系統(tǒng)的影響

王桂華，潘貴書，郭 莉，韓艷春

(1.濱州醫(yī)學(xué)院煙臺校區(qū)生理學(xué)教研室，山東 煙臺 264003;2.遵義醫(yī)學(xué)院，貴州 遵 義 563000)

毒品濫用是當(dāng)今社會上最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一，絕大多數(shù)吸毒者經(jīng)脫毒治療后會再次吸毒。其成癮過程是由偶爾的用藥過渡到強(qiáng)迫性用藥的過程，一般表現(xiàn)為用藥后的欣快狀態(tài)、撤藥后的戒斷反應(yīng)常伴隨嚴(yán)重的精神癥狀如沮喪、焦慮等，尤其是戒斷后的負(fù)性情緒反應(yīng)(如抑郁、焦慮、悲傷、易怒、絕望感、無助感、無價值感等)，對復(fù)吸有很大的影響，也是成癮難以治療的原因之一［1］。設(shè)法改善阿片成癮者負(fù)性情緒的治療可能是一個新的研究方向。研究顯示［2］，情緒障礙時下丘腦－垂體－腎上腺系統(tǒng)功能失調(diào)，如血漿CORT和ACTH水平升高及神經(jīng)肽系統(tǒng)活力變化。

針灸療法對各種疾病的治療在我國已有廣泛的應(yīng)用，“神門”穴在中醫(yī)中用于精神失調(diào)的治療，有研究顯示針刺“神門”穴能減少焦慮相關(guān)癥狀，促進(jìn)杏仁核、海馬和齒狀回細(xì)胞增殖和神經(jīng)肽的表達(dá)［3－4］。韓氏穴位神經(jīng)刺激儀進(jìn)行戒毒治療已取得一定成效。因此，本實(shí)驗探究海洛因成癮戒斷大鼠是否存在負(fù)面情緒反應(yīng);是否與下丘腦－垂體－腎上腺系統(tǒng)有關(guān)系;針刺”神門”穴對海洛因成癮戒斷大鼠情緒相關(guān)癥狀是否有影響，及對下丘腦－垂體－腎上腺系統(tǒng)功能活動的影響，初步探討海洛因成癮戒斷后情緒反應(yīng)的可能機(jī)制以及針刺對其作用的機(jī)制。

Fig 1 Effect of acupuncture on anxiety-related behavior of heroin-withdrawal rats with the elevated plus-maze

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 海洛因(純度83%)貴州省公安廳提供;鹽酸納洛酮注射液(批號20060904)購于湖南益僑制藥有限公司;Fos蛋白免疫組織化學(xué)試劑盒購于北京中杉生物技術(shù)有限公司;ACTH放免分析試劑盒購于北京北方生物技術(shù)研究所;CORT放射免疫試劑盒購自北京市福瑞生物工程公司;AVP放射免疫試劑盒(批號20051016)購于中國人民解放軍總醫(yī)院放免研究所。

1.2 儀器與設(shè)備 LH-402型韓氏穴位神經(jīng)刺激儀，北京力普康醫(yī)藥科技發(fā)展公司提供。高架十字迷宮自動跟蹤系統(tǒng)，四川成都泰盟科技有限公司提供。

1.3 試驗方法 健康SD大鼠32只，♀♂不拘，體質(zhì)量180～220 g。由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗中心提供，許可證號:SCXK-(軍)2002-031。

1.3.1 動物模型建立 將大鼠隨機(jī)分成對照組8只，對照+針刺組8只，海洛因成癮戒斷組8只(簡稱戒斷組)，戒斷組+針刺組(簡稱針刺組)8只。海洛因成癮模型建立參照文獻(xiàn)［5］，按逐日遞增海洛因3 mg·kg－1的原則。首日劑量每次 3 mg·kg－1，1日兩次(上午9:00，下午4:00)連續(xù)皮下注射9 d(第9天劑量達(dá)到27 mg·kg－1);按同樣方式注射等量生理鹽水建立對照組。第10天生理鹽水對照組和海洛因成癮組大鼠各取4只，用5 mg·kg－1納洛酮誘發(fā)戒斷癥狀:可數(shù)癥狀有齒顫、扭體、站立、濕狗樣抖、伸展、清理皮毛，記錄它們的次數(shù);不可數(shù)癥狀有上瞼下垂，每2 min評價一次，以上癥狀觀察30 min，根據(jù)文獻(xiàn)［6］進(jìn)行評分，全部癥狀得分之和為戒斷評分，與已建立的海洛因成癮大鼠模型戒斷標(biāo)準(zhǔn)比較。戒斷組和針刺組大鼠停止給藥，對照+針刺組和針刺組進(jìn)行針刺治療。

1.3.2 HANS針刺 對照+針刺組和針刺組大鼠用乙醚淺麻醉固定，針刺部位相當(dāng)于人的“神門”穴，參照人的取穴部位于腕掌側(cè)橫紋尺側(cè)端，尺側(cè)腕屈肌腱的橈側(cè)凹陷處。在穴區(qū)沿經(jīng)脈或肢體縱向近端約3 mm處放置生理鹽水棉球，于清醒后將不銹鋼針(直徑:0.2 mm)插入左右神門穴，進(jìn)針捻轉(zhuǎn)進(jìn)入，深度3 mm，留針，不進(jìn)行手法刺激，連接LH-402型韓式穴位神經(jīng)刺激儀輸出端，波寬:0.3 mmsec;頻率:2/100 Hz;以大鼠下肢輕微抖動為度，強(qiáng)度為1 mA，2 mA，3 mA遞增，每一強(qiáng)度刺激10 min，共30 min。1 日1 次，連續(xù)7 d［7］。

1.3.3 行為學(xué)實(shí)驗 實(shí)驗大鼠置于實(shí)驗室讓其適應(yīng)20 min后，將大鼠面朝開臂方向放置十字迷宮中心，記錄大鼠5 min在開臂和閉臂停留時間及進(jìn)入開臂和閉臂的次數(shù)(以兩前爪進(jìn)入臂內(nèi)為進(jìn)臂1次)。開臂停留時間的百分比和進(jìn)入開臂次數(shù)的百分比作為焦慮程度的檢測指標(biāo)。

1.3.4 血漿CORT、ACTH和AVP檢測 血標(biāo)本制備:大鼠25%氨基甲酸酯4 ml·kg－1行腹腔注射麻醉后，經(jīng)腹主動脈取血，將血收集于肝素處理的預(yù)冷塑料管中，混勻，4℃離心(3 000 r·min－1，10 min)，取血漿放入－20℃冰箱保存待測。以上標(biāo)本均采用放免試劑盒測定，按照試劑盒說明嚴(yán)格操作。

1.3.5 Fos蛋白檢測 取血后，結(jié)扎胸主動脈，經(jīng)左心室－升主動脈插管，快速灌注300～400 ml磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS，pH 7.4，常溫)沖洗腦組織至流出液體澄清，繼之灌注4℃的4%多聚甲醛溶液(用PBS配制，pH 7.4)250～300 ml，灌注過程中動物四肢抽動，全身發(fā)白，逐漸變硬，持續(xù)灌注30～60 min，然后剝離腦，置于同濃度多聚甲醛溶液中后固定12 h以上。修塊，取下丘腦腦片，梯度乙醇脫水二甲苯透明，石蠟包埋后，行冠狀切片，片厚約4 μm。每只大鼠選取含室旁核下丘腦切片3～5張，用涂有多聚賴氨酸載玻片撈片。以下Fos蛋白檢測按試劑盒要求進(jìn)行。在顯微鏡下觀察照相，成都泰盟公司的B12000圖像處理系統(tǒng)分析，取相同定位點(diǎn)切片計算Fos蛋白染色的平均光密度值 (mean optical oensity，MOD)，用 各 組 MOD(MODx)除以對照組MOD(MODc)，獲得各組相對MOD(releated MOD，ROD)，計算公式為 RODx=MODx/MODc×100%。同時隨機(jī)選6個單位面積對Fos陽性細(xì)胞數(shù)于相同區(qū)域人工計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 高架十字迷宮行為學(xué)測試結(jié)果 統(tǒng)計結(jié)果海洛因成癮戒斷大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)的百分比明顯低于對照組(P＜0.01)。與海洛因成癮戒斷大鼠相比，針刺治療后的戒斷大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)的百分比增高(P＜0.05)。此外，海洛因成癮戒斷大鼠在開臂停留時間低于對照組(P＜0.01)，而針刺治療的海洛因成癮戒斷大鼠在開臂停留時間較海洛因成癮戒斷大鼠停留時間長，組間比較差異有顯著性(P＜0.01)。

2.2 各組大鼠血漿CORT、ACTH及AVP水平統(tǒng)計結(jié)果顯示，見Fig 2，海洛因成癮戒斷大鼠血漿CORT水平明顯高于對照組(P＜0.01)，進(jìn)行針刺治療后CORT水平較戒斷大鼠明顯降低(P＜0.01);血漿ACTH水平，海洛因成癮戒斷大鼠較對照組大鼠水平明顯升高(P＜0.01)，而針刺使海洛因成癮戒斷大鼠血漿ACTH水平降低(P＜0.05);海洛因成癮戒斷大鼠血漿AVP水平明顯高于對照組(P＜0.01);與海洛因成癮戒斷大鼠相比，針刺后血漿AVP水平明顯下降(P＜0.01)。

2.3 各組大鼠下丘腦室旁核Fos蛋白表達(dá) 如Fig 3所示，下丘腦室旁核Fos蛋白表達(dá)通過免疫組化染色為核染色的棕黃色顆粒，對其平均光密度檢測發(fā)現(xiàn)，相對于對照組，海洛因成癮戒斷大鼠下丘腦PVN Fos蛋白表達(dá)MOD值明顯高于對照組(P＜0.01)，見Fig 3A，而針刺海洛因成癮戒斷大鼠下丘腦PVN Fos蛋白表達(dá)MOD值較戒斷大鼠降低(P＜0.01)，見Fig 3A;海洛因成癮戒斷大鼠Fos陽性細(xì)胞數(shù)增加，而針刺使其表達(dá)減少(P＜0.01)，見Fig 3B。

Fig 2 Levels of CORT，ACTH and AVP in plasma of different groups

3 討論

海洛因成癮者普遍存在情緒異常，其中以焦慮和抑郁癥狀最為常見［8］，也是毒癮難戒的非常重要的心理因素。針刺對成癮者情緒異常癥狀是否有影響及其作用機(jī)制是針刺戒毒研究的一個非常重要的方面。高架十字迷宮實(shí)驗是行為藥理學(xué)實(shí)驗中評價動物焦慮程度和藥物抗焦慮效果可靠的實(shí)驗方法。實(shí)驗表明，海洛因成癮戒斷大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)及在開臂停留時間百分比均下降，表現(xiàn)出明顯的焦慮相關(guān)癥狀。對比之下針刺治療后戒斷大鼠在開臂的厭惡回避反應(yīng)明顯減少。說明針刺能減少海洛因成癮戒斷大鼠焦慮相關(guān)癥狀。

Fig 3 Expression level of FOS protein in hypothalamic PVN in rats of different groups

海洛因作用于大腦的獎賞系統(tǒng)產(chǎn)生獎賞效應(yīng)，改變相關(guān)大腦環(huán)路的神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)，使成癮者的神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)異常，這些異常也與成癮者情緒的異常改變有關(guān)［9］。在人體內(nèi)分泌三大分支系統(tǒng)中，焦慮與 HPA 系統(tǒng)關(guān)系密切［10］。Zhou 等［11］實(shí)驗研究證明海洛因成癮大鼠早期戒斷后杏仁核AVPmRNA水平明顯升高，選擇性 V1受體拮抗劑SSR149415能減少應(yīng)激所致海洛因吸食量。亦有研究顯示AVP在調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌活動和焦慮相關(guān)行為起到重要作用［12］。在下丘腦室旁核和視上核，局部釋放的AVP調(diào)節(jié)垂體ACTH釋放［13］。AVPV1受體拮抗劑灌注到有明顯焦慮行大鼠的下丘腦室旁核，觀察到大鼠焦慮行為明顯減少［14］。即刻早期基因c-fos的表達(dá)作為腦功能性的標(biāo)志，廣泛用于反應(yīng)神經(jīng)元活動，可作為信號傳遞通路的第三信使調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞表型的改變，從而調(diào)控細(xì)胞乃至神經(jīng)系統(tǒng)的生理反應(yīng)。下丘腦為間腦前臂，可以接受末端信息，又能調(diào)節(jié)交感神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌功能，室旁核部位表達(dá)的Fos蛋白可能作為第三信使調(diào)節(jié)促皮質(zhì)激素釋放激素的表達(dá)，進(jìn)而控制ACTH的分泌，啟動HPA軸，影響與情緒有關(guān)的行為、神經(jīng)內(nèi)分泌免疫活動［15］。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)海洛因成癮戒斷大鼠血漿CORT、ACTH和AVP水平升高且與焦慮癥嚴(yán)重程度有關(guān)，及下丘腦Fos蛋白表達(dá)增多;針刺能降低這些物質(zhì)的表達(dá)，綜合行為學(xué)結(jié)果提示針刺對海洛因成癮戒斷大鼠焦慮癥狀有一定程度的治療作用，其機(jī)制可能通過調(diào)節(jié)HPA系統(tǒng)功能來實(shí)現(xiàn)。

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