胡黃連苷Ⅱ治療腦缺血/再灌注損傷劑量和時間窗的初步探討

李紅云，趙 麗，宿 希，裴海濤，張美增，辛 輝，郭云良

(青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院1.急診神經(jīng)科、2.中西醫(yī)結合中心、3.神經(jīng)內(nèi)科、4.心內(nèi)科，山東 青 島 266003)

腦缺血/再灌注損傷是由興奮性氨基酸釋放、氧化應激、鈣離子超載、炎癥反應和細胞凋亡等多種因素參與的病理過程［1－3］。神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuronspecific enolase，NSE)和神經(jīng)膠質(zhì)細胞標志蛋白S-100與腦損傷和恢復的程度有密切關系［4－6］。細胞培養(yǎng)研究證實，胡黃連苷Ⅱ能減輕H2O2誘導的 PC12細胞損傷，提高細胞存活率［7－9］。動物實驗研究表明，胡黃連苷Ⅱ可抑制大鼠大腦中動脈閉塞再灌注(MCAO/R)后缺血半影區(qū)的細胞凋亡和相關炎性因子的表達［10－11］。本課題組前期實驗表明，胡黃連苷Ⅱ可通過抑制下調(diào)大鼠腦缺血損傷后炎性細胞因子Toll樣受體4(TLR4)、核轉(zhuǎn)錄因子 κB(NF-κB)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)，以及半胱天冬酶-3(Caspase-3)的表達，減少其底物多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶(PARP)的降解，使PARP利用缺血半暗帶細胞內(nèi)殘存的能量，修復可逆性神經(jīng)細胞損傷，從而抑制腦缺血損傷導致的細胞凋亡［12－16］。但前述實驗均在單一腦缺血時間(2 h)經(jīng)尾靜脈注射應用單一劑量(20 mg·kg－1)的胡黃連苷Ⅱ進行干預，靜脈用藥極為不便。為此，本實驗試圖根據(jù)正交試驗設計原理，經(jīng)腹腔注射胡黃連苷Ⅱ治療，探討其治療腦缺血損傷的最佳治療劑量和時間窗。

1 材料與方法

1.1 動物模型 成年健康♂ SPF級Wistar大鼠，體質(zhì)量240～260 g，由青島市藥物檢驗所實驗動物中心提供［SCXK(魯)20100010］。實驗前動物均置實驗室適應環(huán)境1周，自由進食、飲水;室溫(23±2)℃，自然光照，術前禁食12 h。動物經(jīng)100 g·L－1水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3 ml·kg－1)，仰臥固定、無菌操作，應用線栓法經(jīng)左側(cè)頸外－頸內(nèi)動脈插線建立大腦中動脈閉塞(MCAO)模型［17］。術中和術后用恒溫電熱毯保持動物肛溫36℃～37℃。動物手術麻醉清醒后出現(xiàn)左側(cè)honer's征、提尾右側(cè)上肢屈曲、爬行時向右側(cè)轉(zhuǎn)圈者為模型成功的標志，假手術組插線10mm后即刻退出，其余操作同模型組。

1.2 設計分組 將手術成功的動物模型(16×2)納入統(tǒng)計范圍，按照二因素四水平［L16(45)］正交試驗設計原理分組(Tab 1)。治療時間窗為A因素，設缺血1.0、1.5、2.0、2.5 h 4個水平;治療劑量為 B因素，設 5、10、20、40 mg·kg－14 個水平，如 Tab 1。

Tab 1 Orthogonal experimental disign of【L16(45)】

1.3 干預措施 應用0.1 mol·L－1PBS將胡黃連苷Ⅱ(天津奎青醫(yī)藥公司，CAS No:39012-20-9，純度＞98%，分子質(zhì)量:512)溶解稀釋成1%溶液，按照［L16(45)］正交表中的設計，在相應的缺血時間，腹腔注射相應劑量胡黃連苷Ⅱ，24 h處死動物，檢測相應的指標。

1.4 觀察指標

1.4.1 神經(jīng)行為功能缺陷評分 腹腔注射胡黃連苷Ⅱ 24 h后［(16×2)只］，參考 Bederson's評分［18］標準進行神經(jīng)行為功能缺陷評分，得分越高表示神經(jīng)功能缺陷程度越重，反之則較輕微。0分:未見行為缺陷;1分:前肢屈曲(即提尾懸空實驗陽性);2分:側(cè)推抵抗力下降(即側(cè)向推力實驗陽性)，伴前肢屈曲，無轉(zhuǎn)圈行為;3分:同中度行為，伴自發(fā)性旋轉(zhuǎn)。

1.4.2 腦梗死體積 腹腔注射胡黃連苷Ⅱ24 h后(16 只)，以100 g·L－1水合氯醛 0.3 ml·kg－1腹腔注射麻醉動物，完整取腦，用大鼠切腦模具自前向后連續(xù)冠狀切片，厚2 mm，共5片，置20 g·L－1的氯化三苯基四氮唑(TTC)磷酸鹽緩沖液中，37℃避光染色10 min，置于40 g·L－1多聚甲醛溶液中固定，正常腦組織染為紅色，梗死組織為白色。拍照后用Adobe PhotoShop CS計算梗死面積，以經(jīng)過視交叉平面的腦梗死面積占該層同側(cè)半球面積的百分比(%)表示腦梗死體積。

1.4.3 免疫組化 腹腔注射胡黃連苷Ⅱ 24 h后(16 只)，以100 g·L－1水合氯醛 0.3 ml·kg－1腹腔注射麻醉動物，40 g·L－1多聚甲醛200 ml經(jīng)心臟灌注固定，完整取腦。常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，自視交叉后連續(xù)冠狀位切片，厚5 μm，貼于經(jīng)過多聚賴氨酸處理的載玻片上，烤片機60℃烤片4 h后，4℃保存。兔抗鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和神經(jīng)膠質(zhì)蛋白(S-100蛋白)抗體，SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色液均購自武漢博士德生物工程有限公司。取上述切片，常規(guī)脫蠟至水，按照試劑盒說明書步驟操作，DAB顯色，光鏡下觀察胞質(zhì)有棕色顆粒者為陽性細胞。每只大鼠取5張連續(xù)切片，在400倍光鏡下隨機觀察皮質(zhì)區(qū)5個視野，用Leica Qwin圖像處理系統(tǒng)分析各視野的陽性細胞數(shù)，取其均值。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0版本統(tǒng)計軟件，進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。根據(jù)結果，分析不同水平的缺血(給藥)時間和劑量對試驗檢測指標是否有顯著差異，以及缺血(給藥)時間和劑量的交互作用對實驗檢測指標是否有影響，并得出最佳的劑量和時間窗的組合。檢測結果正交表以腦梗死面積檢測結果為例(Tab 2)，其他結果正交表(略)。

2 結果

2.1 神經(jīng)行為功能評分 治療結束后，各組動物表現(xiàn)為不同程度的功能缺陷，經(jīng)SPSS分析(設定α為0.05)，自變量的交互作用顯著性概率P=0.46＞0.05(Tab 3)，認為時間與劑量無交互作用。方差分析結果可以看出，各個自變量的顯著性概率P=0.02＜0.05，認為給藥(缺血)時間和劑量對神經(jīng)功能的恢復均有影響。應用SSR法進行兩兩比較，計算LSD值，根據(jù)分析結果得出:給藥(缺血)時間1 h(A1)與1.5 h(A2)、2 h(A3)與 2.5 h(A4)之間差異無顯著性(P＞0.05);注射劑量5 mg·kg－1(B1)與 10 mg·kg－1(B2)、20 mg·kg－1(B3)與 40 mg·kg－1(B4)之間差異無顯著性(P＞0.05);其余兩兩比較差異均有顯著性(P＜0.05)。因此，給藥時間與劑量組合以 A1B3、A1B4、A2B3、A2B4較好。從用藥劑量最小化和治療時間窗最大化的角度考慮，以A2B3組合最好，即最佳治療時間窗和劑量分別為缺血 1.5 h、20 mg·kg－1。

Tab 2 Orthogonal layout and the result of infarction volume

Tab 3 Ananalysis of variance about neurological function defect

2.2 腦梗死體積 TTC染色顯示，各組動物大腦中動脈供血區(qū)出現(xiàn)不同程度的梗死病灶，經(jīng)過SPSS分析(設定α為0.05)，自變量交互作用的顯著性概率為0.23＞0.05，認為給藥(缺血)時間與劑量無交互作用(Tab 4)。方差分析結果可以看出:各個自變量的顯著性概率均小于0.01，認為給藥(缺血)時間和劑量對腦缺血后腦梗死面積均有影響。應用SSR

Tab 4 ANOVA of cerebral infraction volume

2.3 NSE蛋白表達 免疫組化染色顯示，各組大鼠腦組織NSE呈不同程度表達，主要在胞質(zhì)著色，呈棕黃或棕褐色。自變量(即陽性細胞數(shù))交互作用的顯著性概率為0.78＞0.05，認為給藥(缺血)時間與劑量無交互作用(Tab 5)。方差分析結果:各個自變量的顯著性概率P＜0.01，認為給藥(缺血)時間和劑量對腦缺血后NSE表達均有影響。SSR法兩兩比較，計算LSD值，根據(jù)分析結果得出:各給藥(缺血)時間NSE陽性細胞數(shù)差異均有顯著性(P＜0.05);各給藥劑量間除20 mg·kg－1(B3)和40 mg·kg－1(B4)之間差異無顯著性外，其余水平間差異均有顯著性(P＜0.05)。因此，給藥時間與劑量組合以A1B3或A1B4組合為好。從用藥劑量最小化和治療時間窗最大化的角度考慮，以A1B3組合最好，即最佳治療時間窗和劑量分別為缺血1.0 h、20 mg·kg－1。

Tab 5 ANOVA of positivbe cells of NSE

2.4 S-100蛋白表達 各組大鼠腦組織S-100蛋白呈不同程度表達，主要為胞質(zhì)著色，自變量(即陽性細胞數(shù))交互作用的顯著性概率為P=0.35＞0.05，認為給藥(缺血)時間與劑量無交互作用(Tab 6)。方差分析結果:各個自變量的顯著性概率P=0.01，認為給藥(缺血)時間和劑量對腦缺血后S-100蛋白法進行兩兩比較，計算LSD值，根據(jù)分析結果得出:給藥時間兩兩比較差異有顯著性(P＜0.05);注射劑量20 mg·kg－1(B3)與 40 mg·kg－1(B4)比較差異無顯著性(P＞0.05);其余組合兩兩比較差異都有顯著性(P＜0.05)。因此，給藥時間與劑量組合以A2B3或A1B4較好。從用藥劑量最小化和治療時間窗最大化的角度考慮，以A2B3組合最好，即最佳治療時間窗和劑量分別為缺血1.5 h、20 mg·kg－1。表達均有影響。SSR兩兩比較LSD值:S-100蛋白表達給藥(缺血)時間1 h(A1)與1.5 h(A2)、1.5 h(A2)和2 h(A3)比較差異無顯著性(P＞0.05)，其余給藥時間水平間差異均有顯著性(P＜0.05);給藥劑量 5 mg·kg－1(B1)與 10 mg·kg－1(B2)、20 mg·kg－1(B2)與 40 mg·kg－1(B4)之間差異無顯著性外(P＞0.05)，其余給藥劑量水平間差異均有顯著性(P＜0.05)。可以得出:給藥時間與劑量組合以A1B3或A1B4或A2B3或A2B4。從用藥劑量最小化和治療時間窗最大化的角度考慮，以A2B3組合最好，即最佳治療時間窗和劑量分別為缺血1.5 h、20 mg·kg－1。

Tab 6 ANOVA of positive cells of S-100

3 討論

正交表能夠在因素變化范圍內(nèi)均衡抽樣，在減少試驗次數(shù)的同時，使每次試驗都具有較強的代表性。正交表具備均衡分散的特點，保證了全面試驗的某些要求，能縮短試驗周期，提高試驗效率，更好的達到試驗目的。本實驗應用正交表對試驗進行整體設計、綜合比較、統(tǒng)計分析，實現(xiàn)通過少數(shù)的實驗次數(shù)找到較好的治療方案，以達到最佳的治療效果。

本實驗檢測指標中，神經(jīng)功能評分是通過大鼠的體征來判斷胡黃連苷Ⅱ?qū)θ毖阅X損傷的治療作用;TTC染色能夠直觀的檢測腦梗死面積，通過直接腦缺血區(qū)域的測定反映腦損傷的程度;神經(jīng)膠質(zhì)細胞標志蛋白 S-100［19－21］和 NSE 是評估腦缺血損傷的敏感指標［22－23］。NSE為一種存在于神經(jīng)組織而不存在于非神經(jīng)組織中的酸性可溶性蛋白。S-100是一種酸性鈣離子結合蛋白，主要存在于神經(jīng)膠質(zhì)細胞。S-100為細胞內(nèi)的鈣受體蛋白，并調(diào)節(jié)能量代謝、促進軸突生長、膠質(zhì)細胞增生，鈣離子內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等。通過檢測腦組織中NSE和S-100的表達可反映胡黃連苷對腦缺血損傷的保護作用。

本實驗按［L16(45)］正交試驗設計分組，大鼠腦缺血1、1.5、2和2.5 h 4個時間點，分別給予胡黃連苷Ⅱ 5、10、20、40 mg·kg－14 個劑量，通過檢測神經(jīng)功能評分、腦梗死面積、NSE及S-100蛋白表達等指標，研究胡黃連苷Ⅱ治療腦缺血損傷的最佳劑量和時間窗。結果表明，注射時間和用藥劑量對于胡黃連苷Ⅱ的治療效果差異有顯著性，不同檢測指標最佳組合結果不盡一致，從用藥劑量最小化和治療時間窗最大化的角度考慮，以A2B3組合最好，即最佳治療時間窗和劑量分別為缺血1.5 h、20 mg·kg－1。由于腦缺血損傷的機制極為復雜，本研究僅觀察了以上4個指標的變化，難免有所偏差。因此，胡黃連苷Ⅱ的確切作用機制和最佳治療時間窗和給藥劑量尚有待于結合其他檢測指標進一步綜合評價。

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