內皮抑素對卵黃囊瘤裸鼠模型血管生長的影響

陳聰德 吳碎春 王 浩 陳肖鳴 張 華

自20世紀70年代Folkman提出血管生成抑制療法以來，目前已發現了多種血管生長抑制因子，特別是近幾年抗血管生成治療發展迅速。血管內皮抑制素(endostatin，ES)是近年來發現的一種新的強效血管生成抑制因子，由于ES特異性地靶向作用于增生的內皮細胞，對轉移性腫瘤和原發性腫瘤的種植瘤均有顯著的抑制作用。但目前國內針對兒童生殖細胞腫瘤的抗血管治療研究甚少，幾乎未見報道。本實驗采用國內首次建立的卵黃囊瘤移植瘤模型為實驗對象，對內皮抑素的抗腫瘤作用進行深入研究［1］。

材料與方法

1．材料:(1)實驗動物及標本:裸鼠BALB/C(nu/nu)小鼠40只，雌雄各半，3～4周齡，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。飼養于溫州醫學院實驗動物中心SPF級實驗室。腫瘤標本來源于小兒卵黃囊瘤荷瘤鼠第17代模型。已對荷瘤鼠腫瘤鑒定，證實保留原腫瘤生物學特性［1，2］。(2)主要試劑:重組人血管內皮抑制素注射液15毫克/(3毫升·支)，避光保存于4℃冰箱，移液器量取，加入醫用生理鹽水，配制成溶液，濃度為 0．06mg/ml及 0．03mg/ml，現配現用。

2．方法:(1)動物模型建立:對荷瘤鼠第17代腫瘤生物學性質再次鑒定，證實具有良好的原腫瘤生物學特性。按照陳聰德等［1，2］人移植瘤模型建立的方法，把第17代腫瘤移植在40只雄性裸鼠單側腹股溝皮下區。(2)成瘤模型分組:裸鼠按照高劑量組 1．5mg/(kg·d)、低劑量組 0．75mg/(kg·d)、實驗對照組、空白對照組分組后開始重組人血管內皮抑制素注射液藥物干預，每日測量裸鼠重量并記錄，依照測得體重數據，計算用藥量。實驗對照組注射醫用生理鹽水25ml/(kg·d)，空白對照組不予干預。于實驗第7天開始干預，注射部位為腫瘤皮下及瘤內。每日定時注射藥物，連續給藥14天。(3)腫瘤生長測量:定期觀察腫瘤生長情況，記錄腫瘤生長的潛伏期和腫瘤生長速度，當腫瘤直徑達3mm時，定人每隔5天用游標卡尺測量腫瘤的最大直徑a及橫徑b，按公式V=π/6 ×a×b2計算腫瘤體積。取第 1、3、6、9、12、15 天腫瘤體積進行各組間點差異的比較。(4)免疫組化標記:雌性裸鼠各組5只，頸椎脫臼法處死，迅速剝離腫瘤，4℃生理鹽水沖洗，觀察腫瘤標本大體形態(表面及切面顏色、有無壞死灶)，4%多聚甲醛固定液固定，石蠟包埋，連續切片。免疫細胞化學步驟參照SP試劑盒提供的說明書進行，AFP、CD34、VEGF的一抗濃度均為1∶100。用Image－pro plus軟件進行圖像分析。隨機選取10個高倍視野，計數免疫組化陽性細胞數及測定陽性細胞的光密度。將兩項數據相乘即為所測樣本的免疫組化染色的相對定量結果(expression value，OD)。用CD34來計算血管密度(microvessel density，MVD)，對腫瘤的新生血管形成進行量化。(5)腫瘤血管造影:1)藥物干預完成后，每組取雄性裸鼠各5只，4%水合氯醛溶液12ml/kg腹腔注射麻醉，沿胸骨左緣打開胸腔，剪開心包膜，暴露心尖部，心尖部穿刺，明膠－氧化鉛懸濁液75ml/kg灌注，至裸鼠鼻尖、趾緣、尾尖、虹膜及腫瘤表層血管變色產生橘紅色斑片狀，清潔裸鼠體表，4℃冷藏過夜以便明膠凝集。2)球管至臺面的高度為102cm，曝光時間為0．25s，電流為100mA，電壓為45V，X線拍片。3)拍片后以Image－Pro Plus圖像分析軟件計算腫瘤血管網平面面積，計算面積比率，面積比率=腫瘤血管網平面面積/腫瘤平面面積，對面積比率進行各組間比較。

3．統計學方法:全部數據經SPSS 13．0統計軟件進行分析，數據以均數±標準差)表示，多組間比較用單因素多重方差分析，組間兩兩比較方差齊者用LSD檢驗，方差不齊者用Dunnett'T3檢驗，取α=0．05作為檢驗水準，以p＜0．05為差異具有顯著性，p＜0．01為差異具有高度顯著性。

結 果

1．各組腫瘤生長狀況:裸鼠移植腫瘤組織后1周，全部接種成功，瘤體開始生長(圖1)。給藥第1天(即分組后)及第3天測量各組間腫瘤體積均無明顯差異(F=0．567，P ＞0．05)，自第 6 天測量內皮抑素治療組，腫瘤生長受到明顯抑制，腫瘤生長速度明顯低于對照組(F=14．254，P ＜0．01);第12天測量結果提示高劑量組與低劑量組腫瘤體積出現顯著差異(F=12．989，P ＜0．01)，實驗對照組與空白對照組比較，各時間點腫瘤體積測量結果均無差異。至實驗結束，內皮抑素高劑量治療組，平均腫瘤抑制率隨治療時間的推移持續增長，最高抑瘤率為第15天測得49%，明顯高于低劑量治療組及實驗對照組;低劑量治療組腫瘤抑制率曲線稍有波動，最高抑瘤率為第15天測得31%;實驗對照組腫瘤抑制率低，且呈下降趨勢，與高劑量組及低劑量組差異明顯(F=15．147，p＜0．01)，不同劑量間腫瘤抑制率存在差異(F=9.628，P ＜0．05)(表1)。

圖1 第18代卵黃囊瘤移植瘤模型

表1 各實驗組腫瘤體積測量結果(mm3)

2．免疫組化結果:各實驗組腫瘤切片中均可見不同程度的AFP表達(圖2)，AFP定位于胞質，染色陽性者呈黃棕色，細胞核及周圍細胞間質無AFP表達處，蘇木素染色呈藍色。CD34表達，從高劑量、低劑量、實驗對照、空白對照的 OD 值為 7．24±4．01、12.28 ±5．59、22．32 ±3．75、22．52 ± 3．06，高劑量組MVD值明顯低于低劑量組(F=18．852，P ＜0．01)及兩對照組(F=20．198，P ＜0．01)，低劑量組 MVD 值低于兩對照組(F=11．323，P ＜0．01)，兩對照組之間無明顯差別(F=1．658，P ＞0．05)(圖 3)。各實驗組從高劑量、低劑量、實驗對照、空白對照的VEGF的OD 值為 12．40 ± 3．25、9．50 ± 3．12、7．08 ± 2．93、7.48±2．39，表達強度上，兩對照組均較強且之間無明顯差別(F=1．459，P ＞0．05)，低劑量組弱于實驗對照組(F=11．225，P ＜0．05)，強于高劑量組(F=15．978，P ＜0．01)(圖4)。

圖2 移植瘤組織AFP表達(×400)

3．腫瘤血管明膠－氧化鉛造影:荷瘤裸鼠血管灌注并拍片后，由X線片可以發現經藥物干預的組別，腫瘤內部未見明顯的壞死空腔，兩個對照組個別腫瘤內部可以見到偏心性壞死空腔。腫瘤周邊部位正常血管。各實驗組腫瘤血管面積比率:高劑量組0．36±0．12、低劑量組 0．49 ±0．04、實驗對照組 0．69 ±0.07、空白對照組0．65±0．12。治療組與對照組之間存在顯著差異(F=12．989，P ＜0．01)，兩治療組之間存在差異(F=1．275，P ＜0．05)。

討 論

睪丸生殖細胞腫瘤的發生率在過去的40年里增加了2倍，達7．5/10萬人［1］。而兒童生殖細胞腫瘤占小兒睪丸腫瘤的60% ～75%，其中以卵黃囊瘤最多。我們首次在國內建立了卵黃囊瘤裸小鼠移植瘤模型，并通過對其生物學特性的鑒定，已經成功應用于對卵黃囊瘤的抗腫瘤研究［2］。本次研究選取卵黃囊瘤模型，為血管密度高、血運豐富的惡性實體瘤，而且血道轉移較多，目前國內尚無針對該瘤血管治療的相關報道。

自20世紀70年代Folkman提出血管生成抑制療法以來，發現了很多具有血管抑制活性的藥物，由其是近幾年抗血管生成治療發展迅速［3～5］。針對血管內皮細胞的抗血管生成療法具有針對腫瘤細胞的化療所不可比擬的優越性，腫瘤細胞具有基因突變性，因而化療容易產生耐藥性且不良反應大，而腫瘤內的血管具有基因的相對穩定性，因而不易耐藥，重復給藥有效。而血管內皮抑制素(endostatin，ES)是近年來發現的一種新的強效血管生成抑制因子，可通過抑制內皮細胞增生和遷移、拮抗腫瘤新生血管生成，阻斷腫瘤血液供應，抑制腫瘤生長而使其進入“休眠狀態”并導致凋亡［6，7］。體內外實驗表明，ES顯示出強大的特異性抑制血管內皮細胞增殖的作用，由于ES特異性地靶向作用于增生的內皮細胞，對轉移性腫瘤和原發性腫瘤的種植瘤均有顯著的抑制作用，一般不會誘發骨髓抑制和胃腸道反應等化療藥物常表現出的不良反應［8～11］。

本實驗結果提示，腫瘤組織中VEGF含量，高劑量組＜低劑量組＜實驗對照組≈空白對照組。關于ES對VEGF的影響機制仍不十分清楚，Hohenester等［12］的研究認為內皮抑素可能是與bFGF和VEGF競爭細胞表面的硫酸肝素黏蛋白類，阻擋有絲分裂生長因子的信號傳導，抑制內皮細胞增殖，并阻止內皮細胞移向bFGF，從而抑制血管生成。目前較肯定的信號傳導通路有:通過抑制EGFR、Raf－Ras－MEK－MAPK、STAT3和PI3K－AKT等信號傳導途徑下調VEGF［13］;通過Thrombin受體啟動PAR －1和PAR －2通路，下調血管內皮生長因子(VEGF)的mRNA和蛋白質表達，從而減少其產生;影響內皮細胞上一氧化氮合成酶的活性，減少VEGF誘導的一氧化氮的生成，從而抑制了VEGF介導的內皮細胞遷移和血管的形成。ES可能通過上述或者尚未知的途徑對腫瘤組織內的VEGF起作用，從而減少其在腫瘤組織中的含量，進而抑制新生卵黃囊瘤血管發生及進展，但具體機制仍需后續研究發現。

本實驗首次選擇明膠－氧化鉛懸濁液作為造影劑應用于卵黃囊瘤裸鼠移植瘤模型。氧化鉛是解剖標本血管灌注造影最常用的造影劑之一，管徑0.1mm的動脈也可以清晰顯影，造影效果保留相對之間較長可以反復拍片觀察，并且操作簡便，價格低廉，適用腫瘤血管的觀察。本實驗結果非常直觀地顯示，經內皮抑素干預后，腫瘤體積明顯小于未經干預者，腫瘤內血管管徑較小，血管分布范圍及密度低，面積比率高劑量組＜低劑量組＜實驗對照組≈空白對照組。也驗證了內皮抑素抗血管生成治療的靶點是新生的卵黃囊瘤血管的觀點。

通過研究筆者發現，ES抑制卵黃囊瘤VEGF的生成，減少其對血管內皮的作用，從而減少血管生成，從而抑制卵黃囊瘤裸鼠移植瘤的生長。為卵黃囊瘤的臨床抗血管生成治療提供有效的實驗依據。

1 陳聰德，陳肖鳴．順鉑誘導體外培養兒童睪丸卵黃囊瘤細胞凋亡機制研究［J］．中華小兒外科雜志，2009，30(7):423－426

2 陳聰德，陳肖鳴．卵黃囊瘤裸鼠移植瘤模型的建立及其生物學特性的研究［J］．中華小兒外科雜志，2010，30(3):176－179

3 Folkman J．Antiangiogenic gene therapy ［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(16):9064－ 9066

4 Kong HL，Crystal RG．Gene therapy strategies for tumor antiangiogenesis［J］．Natl Cancer Inst，1998，90(4):273 － 286

5 Cao Y．Endogenous angiogenesis inhibitors:angiostatin，endostatin，and other proteolytic fragments［J］．Prog Mol Subcell Biol，1998，20:161－176

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