重組人p75NTR169－Fc抗酶裂嵌合體在大腸桿菌中的表達、純化及活性鑒定

景麗玲 王 欣 陳 虹 張俊文

p75NTR(neurotrophins receptor，p75)屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，最初被認定是神經營養素(neurotrophins，NTs)的“通用”受體，但隨著對其研究的深入，發現 p75NTR可以和不同的配體，如proNGF、β －淀粉樣肽(beta amyloid，Aβ)以及和共受體，如Trk，NgR及Sortilin等結合，不僅介導神經元的存活、分化、軸突的生長，還可以介導神經元的死亡［1～3］。p75NTR 與 sortilin 作為 proNGF(proneurotrophins)的受體介導細胞死亡［4］。近年來在神經退行性疾病的研究中，p75NTR作為Aβ的受體越來越引起關注［5～7］。在神經退行性疾病動物模型中，上調p75NTR的水平，導致更多的神經元凋亡。海馬和大腦皮質的膽堿能神經元丟失是AD發病的早期特點，而這些神經元都是高表達 p75NTR的［8］。將 Aβ作用于從p75NTR基因敲除小鼠分離得到的海馬神經元，與Aβ作用于富含p75NTR的海馬神經元相比，Aβ不能引起p75NTR基因敲除的海馬神經元的凋亡卻能引起富含p75NTR的海馬神經元的凋亡［5］。因此，p75NTR已成為研究治療神經退行性疾病如阿爾茨海默病等的一個熱點。

研究顯示，p75NTR是通過胞外區結構域和配體結合，胞內區結構域激活介體(mediators)而發揮效應［9～11］。筆者曾經用畢赤酵母成功的表達過p75NTR194－Fc重組蛋白，但發現該重組蛋白的純化產物中大部分為其蛋白酶降解產物，氨基端氨基酸順序測定證實:蛋白酶切位點位于p75NTR 170位氨基酸。因此，本研究中，我們重新表達了由p75NTR胞外區1～169位氨基酸構成的p75NTR169與人Ig G Fc融合的重組蛋白。該重組蛋白特點為:①保留了p75NTR配體結合區，刪除掉蛋白酶解位點，將不再有因為酶裂產生的低分子質量p75NTR－Fc融合蛋白;②融合人IgG Fc片段后將延長重組蛋白半衰期并方便蛋白純化。重組蛋白p75NTR169－Fc的生物活性實驗研究顯示:該重組蛋白能夠抵抗 Aβ(25－35)對PC12的細胞毒作用，抑制由NGF刺激引起PC12細胞軸突的生長，具有同NGF抗體相同的效果。

材料與方法

1．材料:大鼠PC12嗜鉻細胞瘤細胞系，購自北京協和醫學院細胞中心，培養液為含有5%馬血清及10%胎牛血清的RPMI 1640(Hyclone公司產品)。大腸桿菌菌株DH5α，用于質粒的擴增和轉化;大腸桿菌菌株BL21(DE3)是pET系列質粒表達的宿主菌，質粒pET－28a(+)系蛋白表達載體，均由本室保存。Aβ(25～35)購自 Sigma公司;純化基質 HiTrap rProtein A FF購自GE公司;神經生長因子NGF為R＆D公司產品;兔源多克隆抗p75NTR抗體購自ABCAM公司;兔源多克隆抗NGF抗體購自Santa Cruze公司;辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司。所有引物及基因測序由北京奧科生物有限公司完成。

2．方法:(1)p75NTR169的胞外區、IgG重鏈鉸鏈區和Fc區結構域基因的擴增和拼接:參考 Gene Bank中已知的p75NTR全序列，用軟件Oligo分析后設計如下一對引物:上游引物:5'－TATACCATGG GCAAGGAGGCATGCCCCACAG－3'(含NcoⅠ識別位點);下游引物:5'－tgg gca tgt gtg agt ttt gtc TGT AAT CCA ACG GCCAGG－3'(小寫字母示IgG鉸鏈區順序，大寫字母示p75NTR順序)。免疫球蛋白IgG重鏈恒定區Fc的 DNA片段(216～443)順序源自文獻(Capon．D．et al．Nature，1986，337:525～531)，其上游引物 P216:5'－GAC AAA ACT CACACA TGCCCA C－3'，下游引物P433:5'－ TCGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAG－3'(含EcoRⅠ識別位點)。以本組保存的pUC12－NGFR和人肝cDNA為模板，用上述引物分別擴增出p75NTR(1～169)，Fc(216～433)基因順序，再按照重疊PCR的原則和方法，將兩組擴增產物混合變性、復性后再擴增，得到p75NTR(1～169)－Fc(216～433)融合基因，縮寫為p75NTR169－Fc(圖1)。(2)原核表達質粒pET28a－p75NTR169－Fc的構建:將上述融合基因p75NTR169－Fc經NcoⅠ、EcoRⅠ酶切和回收，與經 NcoⅠ、EcoRⅠ酶切的載體pET28a(+)，在T4 DNA連接酶作用下連接，連接產物轉化感受態細胞DH5α，挑選陽性克隆、重組質粒酶切鑒定，測定克隆片段核苷酸序列。(3)重組蛋白p75NTR169－Fc表達、純化、超濾、除菌及定量:重組質粒轉化宿主表達菌BL21(DE3)，涂鋪于含有卡那霉素抗性的LB固體培養基上，37℃倒置培養過夜。挑選單菌落接種于含有卡那霉素的2ml LB培養基中，37℃，250r/min振蕩培養過夜，按1∶100的比例接種到含卡那霉素的新 LB培養基中，37℃，250r/min振蕩培養2h，至 OD600在 0．5～1．0之間，加入 IPTG至終濃度為1mmol/L，于不同溫度誘導表達12～18h。8000r/min離心10min收集菌體，加入細菌裂解液，超聲破碎，12000r/min離心15min，收集上清和沉淀，SDS－PAGE凝膠電泳及Western blotting檢測。利用AKTA層析系統以protein A親和層析柱純化樣品，全程低溫操作以防止蛋白降解。上樣前，上清需經0．45μm微孔膜過濾。親和層析操作:用結合緩沖液(20mmol/L PBS，pH 7．0)以1ml/min的流速平衡親和柱;將過濾后的上清樣品以0．6ml/min的流速上樣，再用結合緩沖液以1ml/min清洗，直至基線，然后用洗脫緩沖液(0．1mol/L glycine－HCl，pH2．5)洗脫，收集洗脫峰，收集管中預先加入1mol/L，pH9．0 Tris－ HCl 80 ～100μl/ml。將純化后的樣品倒入超濾管中，4℃離心30min，轉速不超過6000r/min，將蛋白樣品壓縮至約5ml，加入PBS離心，重復2～3次，逐步更換緩沖液。0．22μm微孔膜過濾除菌，BCA方法定量，小量分裝，－80℃保存。(4)重組蛋白p75NTR169－Fc基于細胞的功能實驗:1)重組蛋白p75NTR169－Fc干預β－淀粉樣肽Aβ(25～35)對PC12細胞毒的作用:以100μl，約1×104細胞/孔將PC12細胞接種在96孔板中培養，細胞貼壁后分別進行如下分組處理，A組:24h后，以1∶10體積加入終濃度為10μmol/L、5μmol/L、1μmol/L Aβ(25～35)作用細胞 24h，不含 Aβ(25 ～35)的為對照組;B組:24h后，以1∶10體積加入p75NTR169－Fc融合蛋白，終濃度為 1.2μmol/L、0.9μmol/L、0.6μmol/L、0.3μmol/L、0.1μmol/L，0μmol/L;C 組:24h 后，以1∶10體積加入終濃度5μmol/L Aβ(25～35)與不同濃度的p75NTR169－Fc(分別為 0、0．1、0．3、0．6、0．9、1．2μmol/L)。每組設 5 個平行孔，24h后進行MTT檢測。2)p75NTR169－Fc重組蛋白阻止NGF引起的PC12細胞分化:以100微升/孔，約5×103細胞/孔接種PC12細胞于96孔板中培養。細胞貼壁約24h后，以1∶10體積加入終濃度50ng/ml的NGF與不同濃度的NGF抗體或 p75NTR169 － Fc(分別為 0、12．5、50、100ng/ml)，設100ng/ml的p75NTR169－Fc及正常培養的PC12細胞為對照組，每組3個平行孔。48h后每組隨機選取視野拍照。(5)Aβ(25～35)的準備:1mg的Aβ(25～35)用高壓滅菌的去離子水溶解配成終濃度200μmol/L，－20℃存放。使用前在37℃溫育24h。

3．統計學方法:采用SPSS18．0統計軟件進行單因素方差分析，計量資料用均數±標準差)表示，P ＜0．05表示差異有統計學意義。

結 果

1．重組蛋白基因的獲得、在原核中的誘導表達及親和純化:p75NTR包括胞外區(extracellular domain，ECD)、莖區、跨膜區(transmembrane，TM)、胞內區(intracellular domain，ICD)4 區(圖 1A)，p75NTR194－Fc含有170位氨基酸的蛋白酶裂位點(圖1B)，而p75NTR169－Fc保留了完整胞外區和部分莖區的共169個氨基酸，是由人IgG的鉸鏈區鏈接Fc段融合而成，該重組蛋白不含有p75NTR 170位氨基酸以后順序(圖1C)。

圖1 抗酶裂嵌合體p75NTR169－Fc的設計

按照重疊PCR的原則和方法，將兩組擴增產物混合變性、復性后再擴增，得到預期大小(1188bp)p75NTR169－Fc融合基因，如圖2A。融合基因插入到表達載體pET28a(+)后，重組質粒經酶切及DNA測序證實片段的大小、堿基序列和讀碼框正確。表達質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，經IPTG誘導表達后，SDS－PAGE電泳，發現在約50kDa大小處有一特異表達條帶，見圖2B。為進一步驗證箭頭所指條帶為p75NTR169－Fc重組蛋白。經anti－IgG抗體及anti－p75NTR抗體進行Western blotting鑒定，50kDa特異條帶確實為重組蛋白，見圖2C。從圖2B可見，蛋白的可溶性表達在25℃及37℃沒有明顯差異，所以在以后試驗中，我們選擇室溫條件(約25℃)誘導表達。誘導表達的細菌裂解上清液經protein A親和層析柱純化，將分步收集到的蛋白進行SDS－PAGE電泳，銀染鑒定，如圖2D，可見純化后雜蛋白較少，凝膠掃描純度分析所得產品純度可達到96%。

圖2 重組蛋白基因的獲得、在原核中的誘導表達、Western blotting鑒定及親和純化

2．p75NTR169－Fc重組蛋白抑制 Aβ(25～35)寡聚肽對PC12的細胞毒作用:根據文獻報道，Aβ通過p75NTR促進細胞的凋亡［5～8］。本研究中，我們通過MTT檢測Aβ(25～35)寡聚肽對PC12的細胞毒性，發現 PC12 暴露于 10μmol/L 和 5μmol/L Aβ(25～35)24h后，細胞活性顯著下降，與不加 Aβ(25～35)的對照組相比，Aβ(25～35)引起的細胞凋亡有顯著性差異(10μmol/L，5μmol/L:P ＜0．05)，如圖3A;單加0．1～1．2μmol/L的 p75NTR169－Fc重組蛋白對PC12細胞活性沒有明顯的影響(P＞0.05)，如圖3B;如加入5μmol/L的 Aβ(25～35)，同時又加入不同濃度的p75NTR169－Fc，與只加5μmol/L Aβ(25～35)的對照組相比，0．6μmol/L 至 1.2μmol/L p75NTR169－Fc均能抑制Aβ(25～35)引起的細胞凋亡，具有統計學意義(p＜0．05)，如圖3C。每組實驗重復3次以上，證明p75NTR169－Fc對 Aβ(25～35)寡聚肽引起的PC12細胞毒性有抑制作用。

圖3 p75NTR169－Fc重組蛋白抑制Aβ(25～35)寡聚肽對PC12細胞的毒性作用

3．p75NTR169－Fc重組蛋白能夠中和NGF引起的PC12細胞分化:NGF與p75NTR及TrkA結合可以促進細胞的分化，NGF抗體與NGF結合阻止其與受體相互作用。PC12細胞易分化，表現為細胞從圓形的半貼壁變為多邊形或錐形的貼壁細胞，實驗中，與只加培養基的對照組相比(圖4B或圖4C)，加入NGF可以明顯的引起PC12細胞體積變大并產生神經突起，長度可以達到細胞直徑的3倍，如圖4A;加入NGF與不同濃度的NGF抗體后，可以觀察到NGF引起的PC12細胞分化受到不同程度的抑制，如圖4D～F;加入 NGF與不同濃度的重組蛋白p75NTR169－Fc后，也可以觀察到NGF引起的PC12細胞分化受到明顯的抑制，如圖4G～I。

圖4 p75NTR169－Fc重組蛋白對NGF引起的PC12細胞分化的影響 (×100，48h)

討 論

β－淀粉樣肽［Aβ(40～42)］是一種神經毒性多肽，在AD病變中起到了主導作用［13］。它的低聚物是Aβ最強毒性形式，導致AD患者突觸傳導中神經元死亡、神經炎性病變和功能障礙［14］。腦中 Aβ的水平，是通過淀粉樣前體蛋白(APP)分解產生的，正常生理狀態下，新產生的Aβ與經過酶降解和運輸清除掉的Aβ維持在一個動態平衡水平［15］。在神經退行性疾病的細胞研究模型中，上調或通過配體激活p75NTR 都 可 以 導 致 神 經 元 的 死 亡［8］。Aβ 與p75NTR結合后，其胞內區激活下游信號分子如JNK，NF－κB等以及介導tau蛋白磷酸化，最終介導細胞死亡［1］。基于上述主要理論，我們設計并在原核系統中成功的表達了重組蛋白p75NTR169－Fc，期望其類似p75NTR游離受體的活性能夠結合Aβ并抵抗其毒性作用，為AD治療開辟新途徑。

重組人抗酶裂嵌合體蛋白p75NTR169－Fc保留了p75NTR完整的胞外區和莖部9個氨基酸，去掉了易受蛋白酶攻擊的部分，使其不再被蛋白酶降解而提高了重組蛋白的穩定性，我們之前表達的重組蛋白p75NTR194－Fc穩定性差，極易被蛋白酶降解［16］;在p75NTR169－Fc羧基端融合了IgG的Fc段，方便了蛋白純化。在重組DNA設計時，通過合理使用質粒本身的酶切位點，目的蛋白不帶有任何標簽。經凝膠掃描純度分析顯示終產品純度可達96%，為研究其活性提供了保證。此外Fc段蛋白的融合也為延長重組蛋白的半衰期提供了可能性。

Aβ(25～35)保留了Aβ全長的毒性，常用于Aβ的毒性研究。我們通過MTT法研究Aβ(25～35)對p75NTR陽性的PC12的細胞毒作用，表明10μmol/L、5μmol/L Aβ(25～35)作用24h可以明顯殺傷 PC12細胞。而重組蛋白p75NTR169－Fc可以有效地抑制Aβ(25～35)引起的細胞毒性。有趣的是，在本研究中，重組蛋白p75NTR169－Fc的濃度600nmol/L比5μmol/L Aβ(25～35)低近10倍的情況下，仍可有效地與p75NTR競爭，可能與該重組蛋白氨基端的p75NTR的胞外區(ECD)對Aβ的高親和力結合有關。

為了更好地研究重組蛋白p75NTR169－Fc與配基結合的生物學活性，我們通過PC12細胞軸突生長實驗，發現重組蛋白可以抑制NGF引起的軸突生長。根據文獻報道，p75NTR與trkA受體介導NGF引起的軸突生長和突觸連接［2］。在我們的實驗中，50ng/ml的NGF刺激PC12細胞軸突生長;同時加入NGF與NGF抗體或者重組蛋白p75NTR169－Fc，與只加NGF相比，神經軸突明顯變短、數量變少，隨著NGF抗體或者重組蛋白p75NTR169－Fc劑量的增加，抑制軸突生長的程度更加明顯。毋庸置疑，NGF抗體是通過競爭游離的NGF，而減少NGF與受體相互作用的機會，而重組蛋白p75NTR169－Fc保留了和配體結合的胞外結構域，理論上講，其可以和NGF結合，但由于其不含傳遞細胞外信號的跨膜區和胞內結構域，所以重組蛋白p75NTR169－Fc和p75NTR競爭結合 NGF，而不能發揮刺激軸突生長的功能。proNGF是NGF未經蛋白酶切割的前體，也是NGF在AD中存在的主要形式。有研究表明，proNGF通過p75NTR抑制神經軸突的生長。p75NTR169－Fc作為新型重組蛋白，與p75NTR競爭結合配體，有望在AD的治療中，除了結合Aβ也能結合proNGF而發揮一箭雙雕的作用。

針對p75NTR為藥物靶點的研究，不少研究者做了很多的工作，如Yaar M等合成的NGFβ發夾環類似物可以和Aβ競爭結合p75NTR，從而保護神經元免受Aβ介導的毒性作用，而我們構建的重組蛋白p75NTR169－Fc與p75NTR競爭結合Aβ，同樣是為了保護神經元免受Aβ的毒性作用。盡管該工作還有待更深一步的研究，但重組人抗酶裂嵌合體蛋白p75NTR169－Fc是一個有生物活性的新型抗凋亡蛋白，有可能為阿爾茨海默病等神經退行性疾病的治療開辟了又一途徑。

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