系統(tǒng)進(jìn)化樹分析慢性丙型肝炎患者HCV基因分型

王美霞 徐 斌 段 瑾 金 銘

HCV感染極易慢性化。現(xiàn)已證明慢性HCV感染抗病毒治療療效與HCV基因型密切相關(guān)。在我國(guó)HCV感染抗病毒治療指南中對(duì)基因1型和非1型的療程做出了明確的規(guī)定，分別是48周和24周，所以明確患者所感染HCV的基因型對(duì)于決定療程具有重要意義。目前HCV基因分型的方法眾多，尚無“金標(biāo)準(zhǔn)”。本文采用Ohno的分型方法結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹分析來對(duì)浙江省慢性HCV感染者進(jìn)行基因分型。

材料與方法

1．材料:(1)臨床標(biāo)本:60份抗－HCV和HCV RNA雙陽(yáng)性的血清來自于杭州市第六人民醫(yī)院2008年12月～2009年4月期間門診和住院患者，患者戶籍均為浙江省。男性49例，女性11例。患者年齡23～69歲。平均感染時(shí)間8．7年。感染途徑:42例為輸血感染，8例系單采漿還輸血球感染，5例有紋刺史，1例性傳播，4例原因不明。(2)主要分子生物學(xué)試劑:焦碳酸二乙酯(DEPC)購(gòu)自上海英駿生物技術(shù)有限公司，T4DNA連接酶購(gòu)自 NEB公司，dNTP(2．5mmol/L)、瓊脂糖凝膠、EX－Taq酶、pUC18－T載體以及大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)菌均購(gòu)自寶生物大連有限公司，膠回收試劑盒、QIAamp MinElute Virus Spin Kit購(gòu)自QIAGEN公司，RT/Platinum Taq Mix kit、X －gal、IPTG 購(gòu)自 Invitrogen 公司。

2．方法:(1)血清 RNA的抽提:血樣總 RNA的提取按QIAamp MinElute Virus Spin Kit試劑說明書進(jìn)行操作。(2)HCV core基因部分區(qū)段的擴(kuò)增:根據(jù)Ohno的方法，采用巢式RT－PCR擴(kuò)增HCV core基因部分區(qū)段，該區(qū)段位于HCV基因組－12nt～+343nt。①引物序列如下:P2:5'－GGGAGGTCTCGTAGACCGTGCACCATG－3';Sa2:5'－GAG(A/C)GG(G/T)AT(A/G)TACCCCATGAG(A/G)－3';P1:5'－AGACCGTGCACCATGAGCAC－3';Sa1:5'－TACGCCGGGGGTCA(T/G)T(G/A)GGGCCCCA－3';②一步法 RT－PCR擴(kuò)增:用RT/Platinum Taq Mix kit，以P2、Sa2為引物對(duì)血清 RNA進(jìn)行RT－PCR(反應(yīng)體系按說明配比，總體積25μl)。RT－PCR擴(kuò)增程序?yàn)?55℃反轉(zhuǎn)錄30min，94℃預(yù)變性2min，前10個(gè)循環(huán)為94℃ 1min、45℃ 1min、72℃ 1min，接下來25個(gè)循環(huán)為94℃1min、55℃ 1min、72℃ 1min，最后 72℃ 延伸 7min;③PCR 擴(kuò)增:采用EX－Taq酶，以P1、Sa1為引物對(duì)RT－PCR產(chǎn)物再擴(kuò)增(反應(yīng)體系按說明配比，總體積30μl)。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?PCR擴(kuò)增采用熱啟動(dòng)方式，即94℃ 預(yù)變性2min，待溫度升高到80℃后加入Taq酶，隨后進(jìn)入循環(huán)，94℃ 1min、60℃ 1min、72℃ 1min共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。(3)HCV core基因部分區(qū)段的T－A克隆:①PCR產(chǎn)物的回收:按QIAGEN公司膠回收試劑盒說明書進(jìn)行操作，所得產(chǎn)物用于下步試驗(yàn);②回收DNA與PUC18－T載體連接及轉(zhuǎn)化:EX－Taq酶具有脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶的活性，其PCR產(chǎn)物為帶有3'端突出為A堿基的DNA片段，故能高效克隆到T載體上。a．10μl連接反應(yīng)體系中加入7．5μl PCR產(chǎn)物以及0．5μl PUC18－T載體、1μl 10×連接緩沖液以及1μl T4DNA連接酶，4℃連接20h;b．將10μl連接混合物加入到100μl JM109感受態(tài)細(xì)菌中，冰浴 30min，42℃ 熱休克 45 ～50s，快速冰浴 2min，加入800μl不含抗生素的 LB培養(yǎng)液，37℃、180r/min振蕩培養(yǎng)60min，4000g離心2min收集細(xì)菌，在含100μg/ml氨芐青霉素的平板表面均勻涂布40μl X－gal(20mg/ml)和5μl IPTG(200mg/ml)，然后將收集的細(xì)菌均勻涂布在平板上，于37℃培養(yǎng)16h;③陽(yáng)性重組子的篩選鑒定:a．培養(yǎng)16h后可見平板上均勻分布約100多個(gè)藍(lán)色和白色單菌落。挑取白色菌落于600μl含100μg/ml氨芐青霉素的 LB 培養(yǎng)液中，37℃、250r/min培養(yǎng) 6h;b．菌液 PCR鑒定:每管細(xì)菌各取 50μl煮沸10min，4000g離心3min，取1μl上清為模板用 PUC18－T載體通用引物進(jìn)行 PCR鑒定。通用引物為:#1224:5'－CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC－3';#1233:5'－AGCGGATAACAATTTCACACAGGA －3'。反應(yīng)體系包含 dNTP 2．0μl、10 ×buffer 2．0μl、Taq 酶 0．5μl、BcaBEST 引物 RV － M0．5μl、BcaBEST 引物 M13 ～47 0．5μl、菌液 1μl、ddH2O 13．5μl，總體積20μl。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性 2min，94℃ 30s、55℃30s、72℃ 30s共25個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳，陽(yáng)性重組子于500bp左右有特異性擴(kuò)增條帶。

3．HCV core基因部分區(qū)段測(cè)序及分析:選取陽(yáng)性克隆，送上海英駿生物技術(shù)有限公司，以ABI 3730型DNA自動(dòng)熒光序列分析儀進(jìn)行測(cè)序。采用Clustalw分析軟件對(duì)所分離的HCV基因通過進(jìn)化樹分析進(jìn)行基因型分析。基因型分析采用的標(biāo)準(zhǔn)株均來自GenBank，分別為:HCV 1b型(D10074、AJ132996、AF207762、AB010785、AB154177)，HCV 2a 型 (AF177036、AF238482)，HCV 2b 型(AF238486、AB030907、AY232746)，HCV 3a型(AY231691、AF046866)，HCV 3b 型(AY231589、D49374)，HCV 4a 型 (DQ418782、DQ41878、NC:009825、DQ988078)，HCV 5a 型 (AF064490、D50466、NC:009826)，HCV 6a型(AY859526、D88473、DQ480513、D88476)，括號(hào)內(nèi)為HCV各型別GeneBank登錄號(hào)。

結(jié) 果

1．HCV core基因部分區(qū)段的擴(kuò)增:自HCV抗體陽(yáng)性患者血清中抽提RNA并作為模板，經(jīng)巢式RTPCR后，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，33份樣品在約350bp處顯示特異性條帶，與預(yù)期的片段大小相符合，見圖1(因篇幅有限，僅以部分代表)。

2．陽(yáng)性重組子的PCR鑒定:在含氨芐青霉素的IPTG/X－Gal培養(yǎng)板上挑取白色單菌落，培養(yǎng)后取少量菌液pUC18載體通用引物#1233及#1224進(jìn)行PCR，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在約550bp處顯示特異性條帶，與預(yù)期的片段大小相符合。見圖2(因篇幅有限，僅以部分代表)。

圖1 HCV core部分基因片段巢式RT－PCT產(chǎn)物

圖2 陽(yáng)性重組子的PCR鑒定

3．HCV基因型分析:核酸序列基因進(jìn)化樹分析(圖3)。以pUC18通用引物#1224對(duì)陽(yáng)性重組子測(cè)序。采用Clustalw分析軟件對(duì)所獲得的HCV序列做進(jìn)化樹分析以確定其基因型。用于分型的HCV 1－6型及部分亞型標(biāo)準(zhǔn)株共33株，HCV 1b型17株(52%)，對(duì)應(yīng)血清號(hào)分別為:11、36、29、8、24、16、2、55、31、37、54、45、13、34、48、18、51;HCV 2a 型 5 株(15%)，對(duì)應(yīng)血清號(hào)分別為:4、22、32、38、57;HCV 3a型2株(6%)，對(duì)應(yīng)血清號(hào)分別為:9、26;HCV 3b型6 株(18%)，對(duì)應(yīng)血清號(hào)分別為:19、23、43、46、49、52;HCV 6a型3株(9%)，對(duì)應(yīng)血清號(hào)分別為:3、5、42。未發(fā)現(xiàn)有 HCV1a、HCV1c、HCV2b、HCV4、HCV5等基因型存在。

討 論

HCV基因型存在著明顯的地域性分布，且與抗病毒治療的應(yīng)答、疾病的轉(zhuǎn)歸以及胰島素抵抗等均有明確相關(guān)性。浙江省雖然是我國(guó)HCV感染的低流行區(qū)，但總體流行率亦達(dá)2．7%，慢性丙型肝炎及相關(guān)肝硬化和肝癌仍然對(duì)人民健康造成了很大損害［2］。基因分型是預(yù)測(cè)干擾素治療療效的1個(gè)重要因素。迄今為止，只有浙江大學(xué)第一醫(yī)院劉克洲等［3］在1998年按照Okamoto等［4］所建立的型特異性引物巢式PCR基因擴(kuò)增的方法對(duì)浙江省的24例慢性HCV感染者的基因型流行情況作了初步研究，結(jié)果為Ⅱ(lb)為主要流行株，占63．14%，同時(shí)存在la、2a感染的情況。我們的研究結(jié)果表明60份血清中HCV RNA陽(yáng)性者只占33例(55%)，考慮與部分血清保存時(shí)間過長(zhǎng)(超過半年)致RNA降解所致。1b亞型仍然為主要流行珠(52%)，與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)結(jié)果一致。但與之前劉克洲等的研究相比呈現(xiàn)出1b、2a、3a、3b、6a等多種基因型存在的現(xiàn)象，認(rèn)為這與檢測(cè)方法的改進(jìn)、毒株的變異和地域性遷移相關(guān)。

1989年Chiron公司發(fā)現(xiàn)并證實(shí)HCV是造成90%的non－A，non－B肝炎的原因，引發(fā)了HCV基因分型方法探索的熱潮。最早在1993年Simmonds等［5］用親緣關(guān)系分析法，根據(jù)基因序列的同源性將HCV分成6個(gè)基因型和10多個(gè)亞型，并得到國(guó)際上的認(rèn)同;Nakao等［6］以限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析的方法來進(jìn)行HCV基因分型，而Okamoto等［4］和Chayama等以型特異性引物PCR擴(kuò)增的方法進(jìn)行分型。HCV基因分型的方法迄今沒有金標(biāo)準(zhǔn)，目前的分型方法有型特異性探針雜交法，型特異性PCR－RFLP法，基因芯片法，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法，特異引物錯(cuò)配延伸法，異源分子遷移率法和直接測(cè)序法等。目前國(guó)際上基因分型大部分是擴(kuò)增 HCV 5'UTR，core，E1和NS5b的部分基因，克隆后直接測(cè)序。這種方法的缺陷是不能夠?qū)⑺械幕蛐蛥^(qū)分開來。測(cè)序法分型最準(zhǔn)確的是基于全基因組測(cè)序，但這在臨床是難以實(shí)現(xiàn)的。本研究采用Ohno的分型方法結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，即先以巢式RT－PCR擴(kuò)增血清樣品HCV core基因部分區(qū)段(－12nt～+343nt)，克隆并測(cè)序;繼而以Clustalw軟件對(duì)所克隆片段進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析并分型。Clustalw是一種漸進(jìn)的多序列比對(duì)方法，先將多個(gè)序列兩兩比對(duì)構(gòu)建距離矩陣，反應(yīng)序列之間兩兩關(guān)系;然后根據(jù)距離矩陣計(jì)算產(chǎn)生系統(tǒng)進(jìn)化指導(dǎo)樹，對(duì)關(guān)系密切的序列進(jìn)行加權(quán);然后從最緊密的兩條序列開始，逐步引入臨近的序列并不斷重新構(gòu)建比對(duì)，直到所有序列都被加入為止。國(guó)內(nèi)萬(wàn)祥輝等［8］從生物信息學(xué)的角度研究表明以HCV core區(qū)建樹進(jìn)行的基因分型完全正確;認(rèn)為基于系統(tǒng)進(jìn)化樹重建的體系有望成為HCV基因分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

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