脂聯(lián)素基因多態(tài)性與2型糖尿病腎病的關(guān)系

彭春玲 洪郁芝 傅莉萍

糖尿病腎病(DN)是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥之一。據(jù)文獻報道，病程超過25年的1型及2型糖尿病患者中糖尿病腎病的累積患病率高達25%～40%，已經(jīng)成為歐美國家終末期腎病的最主要原因。在我國，它是導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的第2位病因。因此，研究DN的發(fā)病機制，并在此基礎(chǔ)上探索防治DN的有效途徑已成為我們的迫切任務(wù)。人類脂聯(lián)素基因是單拷貝基因，位于染色體3q27，此區(qū)域存在2型糖尿病易感位點，而且有較大頻率的基因多態(tài)性。本研究旨在通過對脂聯(lián)素SNP+45和SNP+276位點上的基因型和等位基因頻率的分析，來探討脂聯(lián)素參與糖尿病腎病的遺傳機制。

資料與方法

1．研究對象:從2009年4～12月在浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬廣興醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科和腎病科住院的2型糖尿病病史在5年以上的患者中篩選82例，均為浙江地區(qū)漢族人，彼此間無血緣關(guān)系。其診斷和分型均符合2007年CDS《中國2型糖尿病防治指南》制訂的標準，根據(jù)尿白蛋白排泄率(UAER)分為3組:＜30mg/24h為正常白蛋白尿組(40例)，男性24例，女性16例;30～300mg/24h為微量白蛋白尿組(25例)，男性15例，女性10例;＞300mg/24h為大量白蛋白尿組(17例)，男性10例，女性7例。入選患者排除血糖控制不穩(wěn)定、腎功能不全、心肺功能不全、發(fā)熱、感染，排除原發(fā)性腎臟疾病和其他繼發(fā)性腎臟疾病，近2周內(nèi)未服用ACEI或ARB類藥物。

2．研究方法:(1)生化指標及臨床資料:所有研究對象在隔夜禁食10～12h后于次日清晨6:00抽取靜脈血6ml，3ml置于普通試管中，送生化室檢測各項生化指標。3ml置于含有EDTA抗凝劑的試管中，3000r/min離心15min取血細胞部分，分裝凍存于－70℃冰箱中，待標本收齊后統(tǒng)一進行檢測。留取24h尿液標本，用濃鹽酸防腐，取部分尿液測定尿白蛋白排泄率。

(2)脂聯(lián)素基因多態(tài)位點+45T/G與+276G/T基因型的檢測:取出－70℃冰箱凍存的血細胞，常溫解凍，按照人血液基因組DNA提取試劑盒(DV811A)(日本TaKaRa公司)說明提取外周血DNA，再行1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用BIO－RAD凝膠成像系統(tǒng)照相記錄，見圖1。以提取出的基因組DNA為模板在50μl反應(yīng)體系內(nèi)進行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。引物設(shè)計參考文獻，寶生物工程(大連)有限公司合成［1］。上游引物:5'－GATGGACGGAGTCCTTTGTAGGTC－ 3'，下游引物:5'－CCAAATCACTTCAGGTTGCTTATG－3'。反應(yīng)體系:10 × Buffer 5μl，MgCl2(25mmol/L)3μl，dNTP(各 2．5mmol/L)4μl，上游引物(10pmol/μl)2μl，下游引物(10pmol/μl)2μl，基因組 DNA 4μl，Taq 酶(5U/μl)0．6μl，ddH2O29．4μl。反應(yīng)條件:預(yù)變性 95℃ 5min，變性 95℃ 30s，退火 59．5℃ 30s，延伸72℃ 30s，末端延伸72℃ 10min，4℃保存，共35循環(huán)。擴增產(chǎn)物452bp。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10μl產(chǎn)物與2μl的6×Loading Buffer混合，加樣于1%瓊脂糖凝膠電泳中進行檢測，用BIORAD凝膠成像系統(tǒng)照相記錄，見圖2。余PCR產(chǎn)物送上海美季生物技術(shù)公司進行純化后測序。

3．統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS 17．0醫(yī)學(xué)統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，各組間基因型分布和等位基因頻率比較用χ2檢驗，各基因型觀測指標的比較用方差分析，p＜0．05有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 人血液中提取的基因組DNA

結(jié) 果

圖2 脂聯(lián)素基因的PCR擴增片段(452bp)

1．各組間的一般臨床資料及生化指標比較:各組年齡、性別構(gòu)成比無明顯差異，BMI、DBP、血糖、HbA1c、TG、TC 、HDL、LDL 組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P均＞0．05)。SBP在大量白蛋白尿組和微量白蛋白尿組均高于正常白蛋白尿組(p＜0．01，p＜0．05)。尿白蛋白排泄率在大量白蛋白尿組顯著高于微量白蛋白尿組和正常白蛋白尿組(p＜0．01)。Ccr在大量白蛋白尿組和微量白蛋白尿組均顯著低于正常白蛋白尿組(p＜0．01)。Scr在大量白蛋白尿組和微量白蛋白尿組均高于正常白蛋白尿組(p＜0.05)，見表 1。

表1 各組臨床、生化指標的比較

表1 各組臨床、生化指標的比較

與正常組比較，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;與微量蛋白尿組比較，#p＜0．01

正常10/7 15/10 24/16年齡(歲) 63．65 ±13．67 61．52 ±11．68 59．70 ±10．22 BMI(kg/m2) 23．93 ±2．79 23．85 ±4．67 23．24 ±2．89 SBP(mmHg) 143 ±13．96＊＊ 137．92 ±18．60*129．55 ±14．28 DBP(mmHg) 80．12 ±10．69 75．32 ±8．82 75．35 ±9．87血糖(mmol/L) 8．15 ±3．42 7．55 ±2．62 7．25 ±2．81 HbA1c(%) 8．51 ±1．77 9．16 ±2．17 8．79 ±2．35 TG(mmol/L) 1．43 ±0．77 1．73 ±0．74 1．82 ±1．04 TC(mmol/L) 4．60 ±0．99 4．87 ±0．90 4．77 ±1．15 HDL(mmol/L) 1．07 ±0．34 1．07 ±0．31 1．07 ±0．26 LDL(mmol/L) 2．65 ±0．82 2．78 ±0．67 2．64 ±0．88白蛋白尿組性別(男性/女性)項目 大量白蛋白尿組微量白蛋白尿組68．30 ±19．39尿白蛋白排泄率(mg/24h) 1562．78 ±1615．15＊＊#86．28 ±48．04 10．46 ±5．60 Ccr(ml/min) 76．24 ±42．92＊＊ 77．95 ±29．76＊＊ 114．11 ±53．21 Scr(μmol/L) 91．00 ±32．07* 87．2 ±47．41*

2．各組基因型和等位基因頻率的比較:大量白蛋白尿組、微量白蛋白尿組和正常白蛋白尿組比較，ANP+45位點基因型和等位基因頻率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均＞0．05)。ANP+276位點基因型和等位基因頻率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均＞0．05)。見表2、表3。

表2 脂聯(lián)素+45位各組基因型和等位基因的比較

表3 脂聯(lián)素+276位各組基因型和等位基因的比較

3．各脂聯(lián)素基因型觀測指標的比較:(1)所有研究對象中，脂聯(lián)素各基因型觀測指標的比較:脂聯(lián)素SNP+45位點的TT、TG、GG 3組基因型的所有觀測指標比較，BMI具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0．05)，TT型與TG型比較有顯著差異(p＜0．01)，余指標的比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P均＞0．05)。脂聯(lián)素SNP+276位點的TT、TG、GG 3組基因型的所有觀測指標比較，無統(tǒng)計學(xué)意義(P均＞0．05)。(2)3組中脂聯(lián)素基因型觀測指標的比較:脂聯(lián)素SNP+45位點，正常白蛋白尿組中，TT與TG型比較，Scr的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0．01);余組中3種基因型的所有指標比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P均＞0．05)。脂聯(lián)素SNP+276位點，大量白蛋白尿組中，TG與GG型比較，DBP的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0．05);微量白蛋白尿組中，TG、GG與TT型比較，尿白蛋白的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.01)。

討 論

2型糖尿病腎病是由遺傳和環(huán)境因素共同作用的一種多基因疾病，其發(fā)生有較大的種族差異。糖尿病腎病的發(fā)病機制尚未完全明確，近年來國內(nèi)外學(xué)者從各方面進行了大量的研究，遺傳因素被認為是其發(fā)生的危險因素之一。流行病學(xué)資料顯示，糖尿病腎病有家族聚集性，此可能與某些基因的突變或多態(tài)性變化有關(guān)。脂聯(lián)素作為一種新型的由脂肪細胞特異性分泌的蛋白質(zhì)，與2型糖尿病腎病相關(guān)。其基因的多態(tài)性調(diào)控著脂聯(lián)素的表達，影響其血清脂聯(lián)素水平以及向糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。

人類脂聯(lián)素基因(APM－1)位于染色體3q27區(qū)域，包括3個外顯子和2個內(nèi)含子，此區(qū)域存在2型糖尿病、代謝綜合征的易感位點，而且有較大頻率的基因多態(tài)性，通過對人類脂聯(lián)素基因全序列分析發(fā)現(xiàn)，正常人脂聯(lián)素基因序列中存在相當數(shù)量的等位基因單核苷酸多態(tài)性，但是密碼子變化并不改變構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸序列。目前國內(nèi)外對定位于染色體3q27區(qū)域的人脂聯(lián)素基因的單核苷酸多態(tài)性與疾病的關(guān)系做了大量研究，發(fā)現(xiàn)不同人群其多態(tài)性與疾病的相關(guān)性不盡相同，這說明在不同的人群中，脂聯(lián)素基因的SNPs可能與遺傳和環(huán)境等因素有關(guān)。

目前己發(fā)現(xiàn)17個脂聯(lián)素基因的遺傳變異，如外顯子2上45位點和內(nèi)含子2上276位點T/G多態(tài)性，－11426位點G/A多態(tài)性等都是常見的單核普酸多態(tài)性。此外，還存在許多稀有突變。既往研究表明SNP+45T/G屬于同義突變Gly15Gly，由于位置靠近外顯子和內(nèi)含子的連接部位，故這一編碼區(qū)的靜止突變可能是通過影響mRNA的剪切機制來影響脂聯(lián)素基因的表達［4］。而SNP+276G/T則遠離剪切位點，其調(diào)節(jié)RNA水平的機制尚不清楚，可能是與不同等位基因造成的不同寡核苷酸轉(zhuǎn)錄文本與轉(zhuǎn)錄因子的親和力不同有關(guān)。有文獻報道SNP+45T/G和SNP+276G/T與脂聯(lián)素基因啟動子區(qū)域的SNP－11391和SNP－11377多態(tài)性位點呈連鎖不平衡，因此這兩個位點的基因多態(tài)性可能對基因的啟動子區(qū)域造成影響而發(fā)揮作用［5］。

多項研究表明，脂聯(lián)素基因外顯子2和內(nèi)含子2的SNP+45T/G及SNP+276G/T多態(tài)性與2型糖尿病和胰島素抵抗明顯相關(guān)。但國內(nèi)外關(guān)于脂聯(lián)素SNP+45T/G和+276位G/T的變異與2型糖尿病腎病的相關(guān)性研究并不多，而且研究結(jié)果也不盡一致。

本實驗研究結(jié)果顯示，脂聯(lián)素SNP+45T/G和+276位G/T的變異和等位基因的頻率在2型糖尿病腎病大量白蛋白尿組、微量白蛋白尿組和正常白蛋白尿組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均＞0．05)，說明這兩個位點的基因型和等位基因頻率的變異與2型糖尿病腎病無相關(guān)性，與 Yoshioka 等［6］、郭志新等［7］的研究結(jié)果一致。Bostrom等［8］發(fā)現(xiàn)瑞典人群中此兩位點的變異與1型糖尿病腎病不相關(guān)。然而，國內(nèi)外亦有研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素的SNPs與2型糖尿病腎病相關(guān)。研究結(jié)果不一致的原因可能是不同的種族和地域，以及不同環(huán)境因素的影響;與我們采用的是西方人群SNPs數(shù)據(jù)庫也有關(guān)。此外，本研究由于樣本例數(shù)不多也會對結(jié)果造成一定的影響，因此，還必須增加樣本量，擴大研究地域的范圍，這樣才有助于我們判斷脂聯(lián)素基因是否為中國人群2型糖尿病腎病的易感基因，

本研究還發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素SNP+45位點，TT與TG基因型比較，BMI具有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0．05)，說明此兩種基因型可能對BMI有影響。脂聯(lián)素SNP+45T/G和SNP+276G/T與2型糖尿病腎病的發(fā)生無相關(guān)性，此兩位點的多態(tài)性并不能預(yù)測2型糖尿病腎病的易感性。

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