唐氏綜合征胎兒21號染色體上新微小RNA基因的鑒定和功能分析

李武縣，徐 勇，2，劉雪燕，秦曉林，梁勤東，戴 勇，4，涂植光

（1.重慶醫(yī)科大學教育部臨床檢驗診斷學重點實驗室，重慶400016；2.廣東省深圳市坪山新區(qū)人民醫(yī)院，廣東 深圳518118；3.廣東省深圳市人民醫(yī)院急診ICU，廣東 深圳518020；4.廣東省深圳市人民醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心，廣東 深圳518020）

唐氏綜合征胎兒21號染色體上新微小RNA基因的鑒定和功能分析

李武縣1，徐 勇1，2，劉雪燕3，秦曉林1，梁勤東1，戴 勇1，4，涂植光1

（1.重慶醫(yī)科大學教育部臨床檢驗診斷學重點實驗室，重慶400016；2.廣東省深圳市坪山新區(qū)人民醫(yī)院，廣東 深圳518118；3.廣東省深圳市人民醫(yī)院急診ICU，廣東 深圳518020；4.廣東省深圳市人民醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心，廣東 深圳518020）

目的：利用Solexa高通量深度測序技術鑒定21號染色體上新的微小RNA （miRNA）基因，為闡明21號染色體功能、探索唐氏綜合征 （DS）患者新的治療靶點提供依據(jù)。方法：收集5例經(jīng)染色體核型分析診斷為DS胎兒的臍帶血和3例正常胎兒臍帶血，分析染色體核型；提取胎兒臍帶血單個核細胞總RNA，構建小RNA文庫，采用Solexa高通量深度測序、計算機分析、Stem－loop RT－PCR法鑒定miRNA基因并分析其生物學功能。結果：血染色體核型分析，5例DS胎兒臍帶血顯示DS標準核型，3例正常胎兒臍帶血顯示正常核型；在DS胎兒臍帶血中共發(fā)現(xiàn)21個新miRNA，其中僅1個候選miRNA來源于21號染色體，位于21號染色體的“DS關鍵區(qū)域”，命名為 “miR－nov21”，后者在DS胎兒臍帶血單個核細胞中表達水平高于正常胎兒。生物學功能分析，miR－nov21可調節(jié)211個靶基因共215個位點，與基因的表達、細胞分化的調節(jié)、胚胎形態(tài)的發(fā)生和心臟的發(fā)育有關。結論：21號染色體 “DS關鍵區(qū)域”存在1個新的miRNA基因——miR－nov21。

微小RNA；唐氏綜合征；高通量深度測序技術；臍帶血

唐氏綜合征 （Down syndrome，DS）又叫21－三體 （Trisomy 21，Ts21）綜合征，因多出1條或部分21號染色體導致的一種出生缺陷型疾病，每700例嬰兒中就有1例［1］。患者表現(xiàn)為先天性智力低下、精神遲鈍、體格發(fā)育不全和先天性心臟缺陷等80多種臨床癥狀［1］。近期生物學研究［2］發(fā)現(xiàn)：21號染色體上含有500多個基因，包括5個微小RNA （microRNA，miRNA） 基 因：miR－99a、let－7c、 miR－125b－2、 miR－155和miR－802。miRNA是一類小的、長度為19～25個核苷酸的內生性單鏈非編碼調節(jié)RNA。可與靶基因mRNA的3′端特異性結合，使其降解或轉錄抑制，在細胞的增殖、分化、凋亡、胚胎的發(fā)育和組織分化等生物學過程中發(fā)揮非常重要的作用［3］。國內外直接或間接的研究［2，4－7］表明：21號染色體上5個 miRNA 的過表達與DS患者各種臨床性狀有關，如智力缺陷、兒童白血病、免疫缺陷和低血壓等。為進一步研究21號染色體小RNA分子編碼基因的功能，本研究首次使用Solexa高通量深度測序技術對21號染色體小RNA編碼基因序列進行研究，探索新的miRNA基因。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年2月—2011年6月于廣東省深圳市人民醫(yī)院行產(chǎn)前診斷、經(jīng)常規(guī)G顯帶染色體核型分析確診為標準型DS胎兒的臍帶血標本5例，正常胎兒臍帶血3例。5例DS胎兒臍帶血中，2例用于小RNA建庫和測序分析，3例用于PCR驗證。該研究由該院倫理委員會批準，且征得所有孕婦知情同意。

1.2 胎兒臍帶血的采集和保存在超聲引導下，抽取18～22孕周DS胎兒 （DS組）和正常胎兒（正常組）臍帶血2～3mL于EDTA抗凝管中（BD公司），采用淋巴細胞分離液 （Invitrogen公司）提取臍帶血單個核細胞，融入Trizol試劑（Invitrogen公司），置于凍存管中，凍存于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 臍帶血RNA提取和Solexa測序 臍帶血單個核細胞小RNA文庫的建立與測序、生物信息學分析在華大基因研究院協(xié)助下完成，整個實驗過程嚴格按照試劑和儀器操作說明書進行。主要實驗流程：采用Invitrogen Trizol試劑盒抽提總RNA，再將2個樣本等量混合，取10μg混合RNA樣品用15%的變性聚丙烯胺凝膠電泳分離回收長度≤30核苷酸的小RNA；在T4RNA連接酶（Promega公司）作用下，在小RNA兩端分別加上 5′ 端（5′－GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC－3′）和3′端 （5′－pUCGUAUGCCGUCUUCUGCUUGidT－3′） 接 頭， 經(jīng) 10% 的 triborate－EDTA（TBE）聚丙烯胺凝膠電泳純化后，由Solexa小RNA反轉錄引物和PCR擴增后制成小RNA的cDNA文庫。再用6%TBE聚丙烯胺凝膠電泳對cDNA文庫進行純化，用Illumina Hiq－2000測序儀進行測序分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理和新miRNA的預測 首先對Solexa測序所得的小RNA分子序列進行去接頭、去低質量和去污染等處理，得到18～30個核苷酸長度干凈序列。然后用SOAP（2.0）軟件將所得干凈序列與人全基因組序列進行比對分析，將匹配上的序列按照 GenBank ＞ Rfam （10.0）＞miRBase17.0＞repeat＞exon＞intron的優(yōu)先級順序進行分類注釋，對未比對上任何注釋信息的序列用 “Unanno”表示。然后將Intron和Unanno的小RNA分子序列作為新miRNA預測的數(shù)據(jù)源，運用MIREAP和MiPred軟件進行新miRNA的預測分析。

1.5 Stem－loop RT－PCR 驗證 為驗證 Solexa測序分析結果的可靠性和21號染色體上新miRNA基因在DS胎兒和正常胎兒中的表達變化，本研究運用SYBR Green Stem－loop RT－PCR對21號染色體上新miRNA的成熟體進行驗證。運用Invitrogen Trizol試劑盒分別提取3例DS胎兒臍帶血和3例正常胎兒臍帶血單個核細胞的總RNA；在ABI－7500實時定量PCR儀上，采用20μL反應體系，運用miRNA分子特異性莖環(huán)逆轉錄引物（中國上海吉瑪公司）和 M－MLV反轉錄試劑盒（Promega公司），經(jīng)逆轉錄反應后，在95℃預變性5min，95℃變性15s，60℃退火15s，72℃延伸32s的反應條件下連續(xù)擴增40個循環(huán)，每個基因設置3個復孔，cDNA濃度為1∶20，以rRNAU6為內參，采用2－△△Ct方法計算21號染色體上新miRNA基因的相對表達量。

1.6 新miRNA靶基因預測和靶基因生物學功能分析 為分析21號染色體上新miRNA的生物學功能，本研究首先用TargetScanHuman Custom（http：／／www.targetscan.org／vert ＿ 50／seedmatch.html）對新miRNA進行在線靶基因預測，然后運用 DAVID 的功能注釋工具 （http：／／david.abcc.ncifcrf.gov／summary.jsp ） 對新miRNA的靶基因進行Gene Ontology生物學功能分析。

2 結 果

2.1 胎兒臍帶血染色體核型分析 3例正常胎兒臍帶血顯示正常核型；5例DS胎兒臍帶血經(jīng)染色體核型分析，顯示均為標準DS核型。見圖1。

圖1 5例DS胎兒和3例正常胎兒臍帶血染色體核型分析結果Fig.1 The chromosome karyotyping results of cord blood in 5DS and 3normal fetusesA：Normal karyotypes；B：DS karyotypes.

2.2 小RNA分子序列分類注釋 通過Solexa高通量深度測序技術對DS胎兒臍帶血單個核細胞小RNA文庫的測序分析，共得到23 324 424條10～30核苷酸長的高質量序列，經(jīng)去接頭、去低質量和去污染序列等處理后獲得21 770 729條18～30核苷酸長的干凈序列，占總量的90.6%，合計280 056種小RNA。運用SOAP （2.0）軟件將所得各種小RNA與人全基因組序列 （hg19）進行比對 （最多允許2個堿基的錯配），得到8 087 250條匹配序列，共58 523種小RNA分子。與公共數(shù)據(jù)庫比對，將匹配上全基因組的小RNA序列分類注釋為miRNA、tRNA、rRNA、細胞核小RNA 序列 （snRNA）、核仁小 RNA 序列（snoRNA）、piRNA、mRNA降解片段、重復序列（repeat）、細胞漿小RNA序列 （scRNA）、信號識別顆粒小 RNA 序列 （srpRNA）、內含子序列（Intron）和未注釋序列 （Unanno），共12類。見表1。

2.3 新miRNA的預測及驗證 通過MIREAP和MiPred軟件的分析，本研究共發(fā)現(xiàn)21個新miRNA （表2）。主要來源于12條染色體，其中僅有1個新miRNA基因來源于21號染色體，位于21號染色體的 “DS關鍵區(qū)域”（chr21q22.2－q22.3）（圖2，見插頁三），本研究將該新miRNA基因命名為 miR－nov21。Stem－loop RT－PCR驗證結果見表3。

表1 與全基因組序列匹配的小RNA分類注釋表Tab.1 The annotation of small RNA species matching the complete genome sequence

表2 經(jīng)MIREAP和MiPred篩出的21個新miRNA分子Tab.2 The 21new microRNAs verified by MIREAP and Mipred

表3 miR－nov21成熟體在3例DS胎兒和1例正常胎兒臍帶血單個核細胞中的PCR驗證結果Tab.3 The PCR results of mature miR－nov21in mononuclear cells of cord blood of 3DS and 1normal fetuses

2.4 靶基因預測和生物學功能分析 采用TargetScan Custom對 miR－nov21進行靶基因預測，得到211個靶基因共215個結合位點。Gene Ontology生物學功能分析，miR－nov21分子調控靶基因與基因的表達、細胞分化的調節(jié)、胚胎形態(tài)的發(fā)生和心臟的發(fā)育有關 （P＜0.001）。見表4。

表4 miR－nov21分子調控靶基因Gene Ontology生物學功能分析結果Tab.4 The Gene Ontology results of target genes of miR－nov21

3 討 論

本研究通過Solexa高通量深度測序技術和新miRNA預測軟件 MiPred以及Stem－loop RT－PCR的驗證發(fā)現(xiàn)：在21號染色體 “DS關鍵區(qū)域”存在1個新的miRNA分子基因 （miR－nov21）。其前體發(fā)夾結構序列長度為83個核苷酸，最小折疊自由能為－32.00kal·mol－1（＜－18kal·mol－1）。miR－nov21成熟體長度為23個核苷酸，位于前體發(fā)夾結構的莖臂上。用UCSC基因分析平臺對miR－nov21進一步分析結果顯示：miR－nov21基因位于β－淀粉樣前體蛋白剪切酶2 （beta－site APP cleaving enzyme 2，BACE2）基因第9個內含子的反義鏈上，提示miR－nov21基因的表達與BACE2基因有關。BACE2蛋白酶可誘導淀粉樣蛋白的生成，造成淀粉樣蛋白的累積使神經(jīng)變性，在阿爾茨海默病和DS患者癡呆的形成過程中具有重要作用［8］。

研究［9］認為：多出的21號染色體上基因表達不平衡是導致DS各種表型的根本原因，而位于21號染色體 “DS關鍵區(qū)域”內基因的表達變化，則在DS患者各種臨床癥狀的形成過程中發(fā)揮重要作用。Stem－loop RT－PCR 結果顯示：miR－nov21在DS胎兒臍帶血單個核細胞中高表達，是對照組的1.5倍，說明miR－nov21與21號染色體上已知的5個miRNA相同，在DS疾病的形成過程中可能具有重要的作用。靶基因分析結果顯示：miR－nov21可調節(jié)CpG－島甲基化結合蛋白2（methyl－CpG－binding protein 2，MeCP2）的表達。MeCP2蛋白是一種轉錄因子，在大部分組織和細胞中均有表達，尤其在腦組織中表達量最高［10］；可與CpG－島甲基化二核苷酸結合，誘導組蛋白修飾和染色質重塑相關蛋白復合體的富集，調節(jié)特定靶基因的表達，對神經(jīng)元的發(fā)育具有重要作用［10］。值得注意的是，MeCP2也是21號染色體上miR－155、miR－802、let－7c和 miR－125b－2的靶基因，與 miR－155、miR－802、let－7c和 miR－125b－2的表達成負相關關系。Kuhn等［2，11］研究發(fā)現(xiàn)：MECP2蛋白在DS胎兒腦組織中低表達，對DS患者的智力發(fā)育具有重要影響。這在DS小鼠模型的腦部海馬組織實驗中得到證實［7］，提示21號染色體上miRNA的過表達與DS患者先天智力缺陷有關。

miR－nov21靶基因的生物學功能分析顯示：miR－nov21與基因的表達、細胞分化的調節(jié)、胚胎形態(tài)的發(fā)生和心臟的發(fā)育有關。在細胞分化的調節(jié)上，miR－nov21可通過與其靶基因3′端特異性結合，調節(jié)其靶基因 SMAP1、ETS1、CDK6、FOXO3、PURB和TOB2的表達，參與調控紅細胞和粒細胞的分化。由于miRNA與其靶基因的表達呈負向調控關系，提示在本研究中miR－nov21的高表達理論上可使其靶基因SMAP1、ETS1、CDK6、FOXO3、PURB和TOB2的表達降低，進而導致紅細胞和粒細胞的分化成熟障礙，參與DS新生嬰兒 “暫時性白血病”以及后期DS患者白血病的形成［12］。此外，生物信息學分析結果顯示：miR－nov21 可 通 過 調 控 BBS4、BMP2、XIRP1、NODAL、 RXRA、 GATA 4、 ADIPOR2、 PTCH1、SOX6和GJC1基因的表達，參與心臟發(fā)育的調節(jié)。研究［13－14］表明：NODAL信號通路與心臟的不對稱發(fā)育有關；GATA4基因的缺失可導致心臟分叉和胚胎死亡，其在心臟發(fā)育早期失活則可導致心肌發(fā)育不良和心內膜墊缺損，而在晚期失活可導致心臟功能的下降。因此，miR－nov21的高表達可能與DS胎兒心臟先天性缺陷的形成有關。

綜上所述，位于21號染色體 “DS關鍵區(qū)域”內的miR－nov21基因與DS疾病的發(fā)生和發(fā)展有密切關聯(lián)。但由于臨床收集樣本較困難，無法對miR－nov21的功能作進一步的臨床驗證。雖然如此，該新miRNA在本研究中的發(fā)現(xiàn)為進一步研究21號染色體的功能、探索DS患者新的治療靶點提供了實驗依據(jù)。

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Identification and functional analysis of chromosome 21－derived new microRNA gene in Down syndrome fetuses

LI Wu－xian1，XU Yong1，2，LIU Xue－yan3，QIN Xiao－lin1，LING Qin－dong1，DAI Yong1，4，TU Zhi－guang1
（1.Key Laboratory of Clinical Medical Diagnostics，Ministry of Education，Chongqiong Medical University，Chongqing 400016，China；2.Pingshan People’s Hospital，Guangdong Province，Shenzhen 518118，China；3.Emergency Intensive Care Unit，Shenzhen People’s Hospital，Guangcdong Province，Shenzhen 518020，China；4.Clinical Medical Research Center，Shenzhen People’s Hospital，Guangdong Province，Shenzhen 518020，China）

ObjectiveTo identify the novel microRNA （miRNA）gene located at the chromosome 21by Solexa high－throughput sequencing technology，and to provide basis for clarifying function of the chromosome 21and investingating the new therapeutic target of Down syndrome （DS）patients.MethodsThe cord blood of 5DS fetues verified by chromosome karyotype analysis and 3normal fetuses were collected.Total RNA was extracted from mononuclear cells of cord blood in DS fetuses to construct the small RNA library.Then the miRNA gene was identified by Solexa high－throughput sequencing，computer analysis and Stem－loop RT－PCR，and its biological function was analyzed.ResultsThe chromosome karyotype analysis showed that the karyetypes in cord blood of DS fetuses were standard DS karyotypes，and those in normal fetuses were normal karyotypes.A total of 21novel miRNAs were identified in cord blood of DS fetuses.But only one candidate miRNA was located on the“DS critical region”of the chromosome 21，named as“miR－nov21”，and its expression level in mononuclear cells of cord bood in DS fetuses was higher than that in normal fetuses.Biological funcation analysis revealed that miR－nov21could regulate 211conserved target genes containing 215conserved sites，which were involved in gene expression，regulation of cell differentiation，embryonic morphogenesis，and heart development.ConclusionThere is a novel miRNA gene in“DS critical region”of the chromosome 21.

microRNA；Down syndrome；high－throughput sequence technology；cord blood

R596

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1141－06

2012－02－06

廣東省科技廳科技計劃項目資助課題 （2012B032000008）；深圳市重點科技計劃資助課題 （201001006）

李武縣 （1985－），男，重慶市人，在讀醫(yī)學碩士，主要從事分子遺傳學與生物化學方面的研究。

涂植光 （Tel：023－68485797，E－mail：tuzhiguang＠yahoo.com.cn）