exosomes:腫瘤免疫治療的新進展

董偉偉 肖文華

exosomes是一類起源于內吞體系統并被排出于細胞外，直徑在40～100nm之間的雙層膜性囊泡［1］。exosomes可以由包括樹突狀細胞、腫瘤細胞等在內的多種細胞分泌［2～6］。最早在 1981 年由 Trams等［7］在研究正常細胞和腫瘤細胞脫落小體的5'核苷酸外切酶的活性時發現并被加以描述。exosomes含有大量與其來源和功能密切相關的蛋白質和脂質成分，做為細胞間傳遞信息的重要載體，參與多種病理生理過程，但大多數研究集中在免疫細胞和腫瘤細胞釋放的exosomes［8～13］。腫瘤細胞來源的 exosomes 含有腫瘤共同抗原、熱休克蛋白等重要的免疫分子，可以通過多種途徑表現出抗腫瘤的作用，且其做為腫瘤疫苗的一種，較DC疫苗有明顯的優勢，其做為一種新的腫瘤排斥抗原的來源，受到了越來越廣泛的關注和研究。本文主要就腫瘤細胞來源的exosomes在腫瘤治療中的應用進行闡述。

一、exosomes抗腫瘤的免疫誘導作用

眾多的研究結果表明，多種細胞來源的exosomes抗腫瘤作用確切，目前已進入Ⅰ期臨床觀察階段［14］。但是exosomes誘導抗腫瘤作用的確切機制仍不十分明確，目前認為可能有以下幾種:

1．MHC等分子介導的腫瘤免疫:腫瘤細胞來源的exosomes(TEXs)中有細胞靶向性相關蛋白(如CD9)和腫瘤抗原運載系統(HSPs)，該系統能將存在于exosomes中的腫瘤抗原轉移到APC。對exosomes的功能研究表明:腫瘤細胞表面的MHC－Ⅰ分子與抗原結合后，通過內吞方式形成多囊體，然后多囊體向胞外釋放exosomes，exosomes通過HSPs系統將腫瘤抗原轉移至DC，并交叉呈遞抗原到MHC－Ⅰ分子上，從而導致CTL的活化并產生有效抗腫瘤免疫，并且exosomes通過MHC等分子引起的腫瘤免疫效應可以跨越組織和 MHC 的限制［15，16］。Sokoll等［17］將人腫瘤抗原MHC－I導入兩種 MHC類型完全不同的小鼠細胞系中，發現小鼠細胞分泌的exosomes攜帶了導入的人腫瘤抗原，而且這種攜帶人腫瘤抗原的exosomes能夠激活小鼠的免疫系統，有效抑制表達MHC－I腫瘤細胞的生長。因此，exosomes有望成為負載腫瘤抗原的一個良好工具。

2 BAT3蛋白介導的腫瘤免疫:exosomes膜表面能夠表達BAT3蛋白，BAT3蛋白是NKP30的一種配體，NKP30是NK細胞上的受體，所以exosomes可以通過其表達的BAT3蛋白與NKP30識別，產生NK細胞介導的抗腫瘤免疫反應。Pogge等［18］和 Simhadri等［19］研究表明，293T細胞釋放的 exosomes表達的BAT3蛋白能夠識別NKP30受體，BAT3在293T細胞上表達是過量還是衰減，直接與exosomes的表達水平及NK細胞介導的細胞因子有關。

3．NKG2D功能配體介導的腫瘤免疫:NKG2D是一個激活受體，其缺失將導致腫瘤免疫逃逸。Clayton等［20］研究發現，包括乳腺癌和間皮瘤在內的大多數腫瘤細胞來源的exosomes通過NKG2D配體發揮作用。NKG2D配體被腫瘤來源的exosomes表達后，可以導致NK細胞增殖從而增強exosomes的抗腫瘤免疫效應。腫瘤細胞分泌的exosomes還可通過修飾效應細胞上的NKG2D受體改變其NK活化作用而發揮抗腫瘤作用。Elsner等［21］發現HSP70作用于腫瘤表達的NKG2D配體，導致腫瘤生長減慢甚至凋亡。Guerra等［22］對小鼠的研究闡釋了 DEXs對 NK細胞的生物活性作用，發現NKG2D可以改變NK細胞的溶解途徑，對轉化或惡變細胞產生一定的殺傷作用。

二、腫瘤細胞來源exosome作為亞細胞瘤苗存在的問題

盡管前期研究，尤其是在動物實驗中，腫瘤來源exosome都取得了令人興奮的效果。但是，近幾年的研究表明:與常用的來自全腫瘤細胞瘤苗一樣，腫瘤細胞分泌的exosome攜帶有大量來自腫瘤細胞的信息，既含有可用作瘤苗的腫瘤抗原和免疫刺激分子，也含有對免疫抑制的腫瘤相關抑制分子，如exosome可通過其膜上的FAS/FASL通路使大量殺傷性T淋巴細胞凋亡［23，24］;通過 exosome 中含有的可溶性NKG2D受體配體使NK殺傷活性大大下降［25］;還可通過exosome中含有的腫瘤細胞分泌的VEGF、SCF等細胞因子刺激機體產生大量髓系來源的抑制性細胞(myloid－derived suppress cell，MDSC)和 CD4+CD25+T調節性淋巴細胞，最終導致機體免疫功能癱瘓［24］。實際上，腫瘤來源exosome作為亞細胞瘤苗的效果是exosome中免疫刺激分子和抑制分子的平衡的結果;如果免疫刺激分子占優勢，那么這種亞細胞瘤苗將在抗腫瘤中發揮重要作用;相反，這種腫瘤來源exosome就不適合作為瘤苗。因此，如何提升exosome中的免疫刺激分子，以提高exosome瘤苗的免疫效應是當前腫瘤免疫治療的熱點之一。

三、增強腫瘤細胞來源的exosomes抗腫瘤作用的策略

腫瘤細胞來源的exosomes可以通過多種途徑發揮抗腫瘤效應，但在研究中發現exosomes單獨的抗腫瘤及免疫調節作用卻是有限的，因此需要通過借助其他手段增強exosomes的活性，以增強其抗腫瘤效應。目前，在研究中常用的增強exosomes免疫原性的方法有以下幾種:

1．腫瘤細胞熱休克:對小鼠淋巴瘤細胞 A20進行熱休克后發現，熱休克后的腫瘤細胞來源的exosomes中含有的免疫分子，如 MHC－Ⅰ、MHC－Ⅱ、CD86、HSPs等，較正常 A20來源的exosomes顯著升高。上述結果表明，通過熱休克的方法可以上調腫瘤細胞及其來源的exosomes的眾多免疫因子，從而增強exosomes的抗腫瘤作用。并且熱休克后的腫瘤細胞來源的exosomes與正常腫瘤細胞來源的exosomes相比較，還有以下優點:可誘導成熟和活化未成熟DC;能直接刺激同種異體小鼠 T細胞增殖;具有高效的抗腫瘤免疫作用;可誘導Th1型免疫和抗原特異的CTL。并且熱休克來源的exosomes含有許多重要的趨化因子，能夠趨化、黏附DC和直接活化T淋巴細胞［23］。Chen等也發現從熱休克的腫瘤細胞提取出來的exosomes(HS－TEX)較非熱休克腫瘤細胞提取的exosomes能更強的吸引并激活DC細胞和T細胞。研究發現HS－TEX包含CCL2、CCL3、CCL4、CCL5和CCL20等炎癥趨化因子，在體內和體外都能很強的吸引CD11c+DC和CD4+/CD8+T細胞。另外，HS－TEX的產量可以被ATP抑制劑、鈣螯合劑、膽固醇清除劑所抑制，這些表明趨化因子進入exosomes是ATP和鈣依賴的并且通過一個脂質載體依賴的途徑。同時發現熱休克后細胞趨化因子具有聚集在脂質載體上的特性，瘤內注射HS－TEX可以更好的介導特異的抗腫瘤免疫反應，而且可以看到明顯的腫瘤生長緩慢和荷瘤小鼠壽命的延長。

2．基因修飾:Yang等轉染 IL－2基因進入E．G7－OVA腫瘤細胞，然后分離exosomes，通過 ELISA和 western blotting在exosomes中檢測到了IL－2，然后把Exo/IL－2皮下注射到荷瘤C57BL/C小鼠體內，并研究其抗腫瘤效果。結果發現Exo/IL－2疫苗可以顯著上調抗原特異性Th1及CTL細胞的抗腫瘤免疫反應，明顯抑制腫瘤細胞的生長，表達 IL－2的exosomes能使80%的小鼠長期存活。另有研究轉染IL－12到腎癌細胞，然后從上清液中提取exosomes，檢測轉染IL－12后exosomes的抗腫瘤活性。結果發現轉染IL－12后的腎癌細胞分泌的exosomes中IL－12的含量及腫瘤相關抗原G250明顯增加。exosomes－GPI－IL－12疫苗能高效介導γ干擾素的釋放及刺激殺傷性T淋巴細胞的活性，從而使exosomes抗腫瘤效應明顯增加。通過IL－18基因轉染腫瘤細胞也能顯著增強腫瘤細胞來源的exosomes的抗腫瘤效應。我國學者也證實IFN－γ基因轉染的腫瘤細胞來源的exosomes含有IFN－γ，并且發現Exo/IFN－γ具有比常規exosomes更顯著的抗腫瘤效應。

3．靶蛋白錨定:腫瘤細胞來源的exosomes是一種膜被囊泡，經蛋白轉染法將靶蛋白錨定在exosomes表面，可高效的激活CD8+T細胞及CD4+T細胞。通過蛋白轉染的方法將靶蛋白錨定在膜上形成的腫瘤疫苗可以明顯改善抗原免疫和治療效果，為增強exosomes的功能提供了新的思路。MVA－BN－PRO(BN immunotherapeutics)是一種可以治療前列腺癌的免疫治療方法，該產品編碼兩種相關的特異性抗原，列腺癌特異性抗原(PSA)和前列腺酸性磷酸酶(PAP)，都是從高度稀釋并經過處理的牛痘安卡拉病毒(MVA)提取出來的，被稱作MVA－BN。早先研究已經證明把抗原錨定到exosomes后可以增強抗原的免疫原性。Rountree等將錨定方法改善后，即先把抗原融合到乳黏素蛋白的C1C2區域，形成MVA－BN－PSA－C1C2及MVA－BN－PAP－C1C2，然后錨定到exosomes，再來檢測exosomes錨定后PSA或PAP的免疫原性是否會改變。結果發現，用MVA－BNPAP－C1C2錨定的exosomes治療鼠前列腺癌獲得了驚人的抗PAP免疫反應，抗PAP抗體效價較MVABN－PRO升高了10～100倍，而PAP特異性的T細胞數量升高了5倍，這對PAP陽性的實體瘤治療具有重要意義。同樣，MVA－BN－PSA－C1C2錨定exosomes也提高了PSA的抗原性并且在PSA陽性的實體瘤中表現出了明顯的抗腫瘤活性。

4．表觀遺傳藥物修飾:前期基礎研究表明:DNA甲基化抑制劑——5－脫氧雜氮胞苷和組蛋白去乙酰化酶抑制劑——丙戊酸鈉、TSA等均可誘導睪丸－腫瘤特異抗原(CTA)的表達、MHCⅠ、Ⅱ類抗原的高表達以及共刺激分子表達，并且在動物實驗中能顯著增強抗CTA的特異性免疫反應。國內肖文華等采用表觀遺傳學藥物5－脫氧雜氮胞苷和MS－275處理肝癌細胞后，其產生的exosomes中的CTA抗原NYEESO、HLA－I含量顯著增加。并能顯著改善未經表觀遺傳藥物修飾的腫瘤來源exosomes對體外淋巴細胞增殖的影響。近一步發現還可顯著增強體外NK細胞殺傷活性(資料尚未發表)。此外，肖文華等還發現人卵巢癌腹腔積液中也存在大量不同來源的exosomes，在這些exosomes中存在大量免疫刺激分子，表明腹水來源exosomes可是很好的抗腫瘤的亞細胞瘤苗。

5．exosomes包裹藥物:Zhuang等用 exosomes包裹抗感染藥物通過鼻腔給藥治療炎癥介導的腦病。他們首先制作了3種小鼠炎癥介導的腦疾病模型:脂多糖介導的腦炎模型、自身免疫性腦炎模型、GL26腦腫瘤模型，然后用exosomes包裹姜黃素(Exo－cur)或信號轉導蛋白和轉錄激活抑制因子3(Exo－JSI124)，通過鼻腔給藥途徑傳遞給腦小膠質細胞。結果發現:用Exo－cur或Exo－JSI124鼻腔給藥對脂多糖介導的腦炎有保護作用，對GL26腦腫瘤的生長起到了明顯的抑制作用。鼻腔給藥途徑能迅速地把Exo－cur或Exo－JSI124傳遞到大腦部位，然后選擇性的被腦小膠質細胞攝取，最終介導了腦小膠質細胞的凋亡。這個實驗為治療炎癥介導的腦病提供了一個新的非侵襲性的治療方法，也為exosomes治療其他部位腫瘤提供了思路。另有研究表明，exosomes納米技術是一個新出現的重要的藥物運輸途徑，開發exosomes納米囊泡運輸RNAi預示藥物可以跳過人體內生物障礙，從而為體內藥物應用途徑開辟新的篇章。DC來源的exosomes在全身注射以后可以定向的運輸RNAi到大腦，為這些自然存在的囊泡開發為可以運輸藥物的囊泡提供了可以信服的證據。就像體內定向應用脂質體和病毒順從性很好一樣，來自病人自身組織的exosomes可使運輸藥物的囊泡具有很好的組織相容性，并且可以穿過體內的血腦屏障，所以具有更好的安全性和個體化來源。

四、腫瘤細胞來源的exosomes瘤苗的應用前景

腫瘤的發生是由于機體免疫監視功能低下或缺陷，使腫瘤細胞通過免疫逃逸而克隆性增生的結果。因此，目前可激發荷瘤機體特異性抗瘤應答的腫瘤疫苗成為人們普遍關注的熱點。免疫細胞和腫瘤細胞分泌的exosomes表面富含MHC分子和腫瘤抗原，可有效輔助抗原呈遞，打破原有的免疫耐受，在腫瘤免疫治療中已經顯示出一定效果，如在肺癌和晚期黑色素瘤患者中已經觀察到明確腫瘤逆轉現象［15］。腫瘤的主動免疫治療研究最多的是DC疫苗，以DC為基礎的腫瘤免疫治療能有效激發細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應，發揮明確的抗腫瘤效應。但也存在如大量生產和保存及DC質量參數確定等難點，導致了DC疫苗難以廣泛應用于臨床實際中，并且由于致敏DC所需的抗原劑量尚未明確、以何種方式負載腫瘤抗原效果最好尚不明確、過量的DC可能會導致體內CTL耗竭，甚至引發自身免疫性疾病等問題的存在也進一步限制了DC疫苗在臨床上的廣泛應用。

而exosomes疫苗則有效地避免了DC疫苗存在的上述問題。與DC疫苗相比，exosomes疫苗有如下優點:①exosomes疫苗具有整套細胞自身的抗原成分及自身細胞特殊功能相關的蛋白，可引導exosomes準確到達靶細胞;②來源廣泛，抗瘤效果肯定;③可以在細胞之間傳遞抗原信息并在體內外產生特異性抗腫瘤免疫應答;④通過HSPs攜帶腫瘤細胞的抗原，傳遞腫瘤抗原肽，提供NK細胞和T細胞作用的相關靶點，激發T細胞免疫應答、增強CTL、NK細胞的抗腫瘤效應;⑤可以通過腫瘤細胞熱休克、基因修飾、靶蛋白錨定等方法增強exosomes疫苗的腫瘤抑制作用;⑥非細胞成分，無繁殖能力，抗原性弱，不良反應小，穩定高效;⑦exosomes疫苗穩定，一旦獲得即可長時間冷凍貯藏;⑧能使T細胞產生記憶性免疫應答;⑨exosomes可不被激活的CTL細胞所抑制，從而發揮更為持久的抗原呈遞作用;⑩分離和提純方法已成熟和完善，國外已可按照藥品生產質量管理規范(good manufacturing produces，GMP)進行大規模工業化制備，實際使用中的可操作性和可控性更強。exosomes疫苗多靶點高效的抗腫瘤作用使之有望取代DC疫苗并成為一種新型腫瘤疫苗，從而使其具有更廣闊的臨床應用前景。

五、結 語

現在已經很清楚不僅免疫細胞，幾乎所有的細胞均可分泌exosomes。而發現exosomes中含有豐富遺傳物質，比如mRNA及miRNA，是最近該領域一個重大突破，揭示exosomes在細胞基因信息傳遞方面起重要作用。目前對exosomes的研究已經遠遠超過在神經生物學，干細胞以及腫瘤生物學領域，尤其是在腫瘤臨床應用方面，比如生物標志物和腫瘤免疫治療研究等領域，還有廣闊的前景。但是由于腫瘤細胞自身攜帶的信息數量龐大、來源于不同種類細胞exosomes的結構功能亦復雜多變，目前對exosomes的研究仍處于起始階段，作為一種新型的抗腫瘤藥物或腫瘤疫苗，其發生機制、生物學特性、免疫調節的機制以及如何進一步增強其作用尚需進一步深入研究。

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