microRNA在膠質瘤研究中的進展

包慶泉 邵君飛

microRNA(miRNA)是一類長度為19～25個核苷酸的非編碼低分子RNA。盡管直到20世紀90年代初miRNA才被發現并開始陸續報道，但是隨著研究的深入，miRNA已被認為在腫瘤的發生發展中扮演著重要的角色。目前已經知道，miRNA主要通過與靶基因mRNA3'－UTR完全或不完全配對，導致靶標mRNA降解或轉錄后翻譯抑制，從而參與個體發育、細胞凋亡、增殖及分化等生理過程。miRNA在表達水平發生變化后將直接影響其下游調控靶基因的表達進而參與腫瘤的發生機制。因此，研究膠質瘤中miRNA的表達情況可以為膠質瘤的診治提供新的思路。本文主要對膠質瘤中miRNA的最新研究進展做一綜述。

一、microRNA與腫瘤

近年來隨著分子生物學新技術的不斷涌現，人們對miRNA與腫瘤關系的認識也逐漸得以深入。目前關于miRNA在各種腫瘤中的研究均有文獻報道。在卵巢癌與 miRNA的研究中，Guan等［1］發現 miR－125b在卵巢癌細胞中表達下調，并且miR－125b能調控原癌基因BCL3的表達。實驗中發現，轉染了miR－125b的腫瘤細胞的增殖速率明顯慢于對照組，腫瘤細胞普遍被抑制于G2期。Guan等因此認為miR－125b在卵巢癌的發生過程中起了重要作用。在結直腸癌的研究中，Koga等［2］發現，相對于正常組織，結直腸癌組織中miR－17－92，miR－21以及miR－135的表達出現明顯上調。另外，Liu等［3］在檢測了28例食管鱗狀細胞癌患者的腫瘤標本的miR－17－92表達特點后也發現，75%的標本中的miR－17－92存在著過表達。上述研究中確定了miR－17－92簇在多個腫瘤組織和細胞系中表達上調，轉基因動物實驗證實miR－17－92簇具有增加淋巴系統腫瘤發生率的作用，因此miR－17－92簇被視為第一個哺乳動物中的癌miRNA—OncomiR－1。所以miRNA與腫瘤發生的關系可以總結如下:miRNA在表達水平發生變化后將直接影響其下游調控基因的表達進而參與腫瘤的發生機制［4］。

二、microRNA 與膠質瘤

人腦膠質瘤是顱內最常見的原發腫瘤，其中惡性膠質瘤約占60%，即使聯合手術、放療和化療，惡性膠質瘤的中位生存期也只有診斷后9～12個月。隨著分子生物學研究的深入及其在腫瘤研究中的應用，已經證實膠質瘤和其他腫瘤一樣，也是由多基因、多步驟發展演變而來，各種致癌因素通過激活一種或多種原癌基因的表達及抑制抑癌基因的表達或導致其突變、缺失從而使腫瘤細胞逃避了正常生長調控機制，出現異常增殖、自主侵襲、血管增生等惡性生物學表型。到目前為止，已經發現很多基因(包括癌基因、抑癌基因等)與膠質瘤的發生和進展有關，但仍沒有闡明膠質瘤發生發展的機制［5～7］。因此應用不斷創新的生命科學的前沿技術研究膠質瘤發生發展的機制，并進一步探索新的有效治療方法一直是當今神經外科領域前沿課題。近年來隨著miRNA研究的興起，無疑為膠質瘤的診治提供了新的思路。成熟的miRNA是由較長的初級轉錄物經過一系列核酸酶的剪切加工而產生的，隨后組裝進RNA誘導的沉默復合體，通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并根據互補程度的不同指導沉默復合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。由于miRNA主要通過與靶基因mRNA3'－UTR完全或不完全配對，導致靶標mRNA降解或轉錄后翻譯抑制，因此一個miRNA可有多個靶點，有研究指出多達30%的基因受到miRNA 的調控［8］。

1．microRNA與膠質瘤的表達:如前所述，microRNA與腫瘤關系密切，那么膠質瘤當然也不例外。Sliber等［9］應用定量RT－PCR的方法對多形性成膠質細胞瘤、間變性星形細胞瘤及無瘤的腦組織細胞的miRNA表達譜進行了研究，發現miR－10b在多形性膠質母細胞瘤及間變性星形細胞瘤中表達明顯上調;而miR －7、miR －124、miR －129、miR－137等則在多形性膠質母細胞瘤及間變性星形細胞瘤中表達下調。進一步的實驗發現，向多形性膠質母細胞瘤內轉染了miR－124或miR－137后將引起多形性膠質母細胞瘤U251和SF6969細胞停止增殖于G1期。Sliber等的研究表明，可針對miR－124或miR－137對多形性膠質母細胞瘤進行靶向治療。類似的，Liu等［10］運用高通量的微陣列技術對髓母細胞瘤和正常腦組織中的miRNA表達量進行對比研究發現，相對于正常腦組織，miR －17、miR －99a、miR －100、miR －106b在髓母細胞瘤中表達明顯上調，而miR－218、miR－29a、miR －29c、miR －128a、miR －127 －3p 則明顯下調。Liu等因此指出，鑒于miRNA在髓母細胞瘤和正常腦組織中的表達差異，推測miRNA可能在髓母細胞瘤的腫瘤發生中起重要作用，并且在將來miRNA有望成為髓母細胞瘤治療的潛在靶點。隨著miRNA研究的興起，目前已有很多種miRNA與膠質瘤研究的文獻可供檢索。下面筆者將對近年來膠質瘤中研究較熱的一些microRNA進行介紹。

2．miR－21:近年來在膠質瘤中研究最火的miRNA當屬miR－21。目前已知，miR－21在各項腫瘤中存在過表達，當然膠質瘤也不例外。Shi等人通過反義技術構建了miR－21敲低的膠質瘤細胞模型，成功構建模型后對細胞進行增殖、侵襲和凋亡能力的檢測。結果發現，miR－21敲低的U87細胞出現增殖速率減緩、侵襲能力降低和凋亡增加的現象。Shi等人同時還檢測了 caspase－3、caspase－8、caspase－9和PTEN的表達。檢測結果發現 caspase－3和caspase－9表達明顯增加而caspase－8和PTEN無明顯變化。Shi等人就此認為，miR－21在膠質瘤細胞中起著抗凋亡的作用，抑制miR－21的表達能激活caspase－3和caspase－9從而誘導膠質瘤細胞凋亡［11］。Shi等人的觀點也被Zhou等人的實驗結果所證實，他們還大膽地提出miR－21可作為膠質瘤基因治療的一個靶點［12］。在膠質瘤中，存在著 Spry2介導的Ras/MAPK負反饋通路，該通路對腫瘤細胞侵襲能力的調控起重要作用。該通路一旦受干擾，那么勢必將引起腫瘤細胞侵襲能力的增強。Kwak等的實驗則就發現了一個能干擾該通路的因素:高表達的miR－21。他們的實驗發現:那些WHO分級在Ⅱ到Ⅳ級的膠質瘤組織中Spry2的表達量下降了79．7%，而正常腦組織和WHO分級在Ⅰ級的膠質瘤組織中的Spry2的表達則無明顯差異;膠質瘤中Spry2的表達和miR－21的表達呈現負相關的趨勢。因此，Kwak等人認為，在高度惡性膠質瘤中高表達的miR－21通過轉錄后調控下調Spry2的表達這一機制對膠質瘤的惡性進展起著至關重要的作用。他們還認為，Spry2可能有望成為惡性膠質瘤的又一治療靶點［13］。替莫唑胺TMZ由于其促凋亡作用而被用于膠質瘤的臨床治療。一項膠質瘤化療藥物替莫唑胺TMZ作用與miR－21關系的實驗研究表明，在那些miR－21高表達的U87MG細胞中，TMZ的促凋亡作用明顯降低。同時那些miR－21高表達的U87MG細胞中存在著Bax和caspase－3的下調及Bcl－2的上調。進一步的研究揭示，正是高表達的miR－21引起了Bax和caspase－3的下調及Bcl－2的上調，從而部分抑制了TMZ的促凋亡作用。該研究也揭示了為什么臨床上化療藥物TMZ治療膠質瘤會引起抵抗［14］。

3．miR－7:已有文獻報道表明，miR－7在多形性膠質母細胞瘤及間變性星形細胞瘤中表達下調［9］。關于miR－7在膠質瘤中參與的調節機制研究，下面兩篇文獻可供參考。目前已發現，在許多腫瘤中存在表皮生長因子(growth factor receptor，EGFR;human epidermal growth factor receptor 2，Her－2)的異常表達，這些受體酪氨酸激酶在腫瘤發生發展過程中起著重要作用。而蛋白激酶B和蛋白激酶Akt，做為上述這些受體酪氨酸激酶的下游調節因子，參與著腫瘤的細胞增殖、侵襲、血管形成、抗凋亡等信號通路。Giles等［15］的實驗表明，在膠質母細胞瘤中，miR－7直接負調控EGFR和Her－2的表達，同時發現，miR－7也下調了蛋白激酶Akt活性。因此，miR－7可通過降低蛋白激酶Akt活性最終參與調節膠質母細胞瘤的發生發展的信號通路。Lee等［16］做了類似的研究，他們通過構造過表達和抑制miR－7的U251及U87惡性膠質瘤細胞模型，用western blotting技術檢測了相應細胞中EGFR、PI3K、AKT等的含量后發現，過表達miR－7的惡性膠質瘤細胞EGFR、PI3K、AKT的含量較正常表達miR－7的惡性膠質瘤細胞明顯下調，而下調miR－7表達的惡性膠質瘤細胞EGFR、PI3K、AKT的含量則正好相反。同時，在相同劑量輻射量下，過表達miR－7的惡性膠質瘤細胞生存曲線明顯較其他兩者下降。因此，Lee等提出，鑒于miR－7能通過調節EGFR－PI3K－AKT信號通路削弱膠質瘤細胞對輻射的耐受性，miR－7將有望成為膠質瘤的一個有效治療靶點［16］。

4．miR－128:Zhang等在組織和細胞水平檢測了膠質瘤及正常腦組織中miR－128的表達后發現，相對于正常腦組織，膠質瘤組織及細胞中miR－128的表達均出現下調。Zhang等的研究表明，miR－128可通過靶向作用于E2F3a(E2F3a是一種調節細胞周期轉錄因子)－3'UTR來抑制膠質瘤細胞增殖。此外，他們還發現，E2F3a敲低與miR－128過表達的作用相似，而E2F3a高表達可部分解除miR－128抑制細胞增殖的作用［17］。類似的，Cui等通過高密度miRNA熒光報告分析及Northern blotting分析檢測了多形性膠質母細胞瘤(GBM)和正常腦組織中miR－128的表達發現，相對于正常腦組織，在GBM中miR－128的表達明顯下調，并且與GBM的WHO分級有關，分級越高的，miR－128的表達下調越明顯。Cui等人還對已被生物信息學證實的miR－128的3個靶點ARP5(ANGPTL6)、Bmi－1和E2F－3a在多形性膠質母細胞瘤(GBM)和正常腦組織中的表達差異進行了進一步研究。研究結果顯示，相對于正常腦組織，ARP5、Bmi－1和E2F－3a在多形性膠質母細胞瘤(GBM)中無論是mRNA水平還是蛋白質水平都出現了明顯的上調。結合ARP5、Bmi－1和E2F－3a三者各自的生理功能和實驗結果，Cui等［18］指出，miR－128能通過上調ARP5、Bmi－1和E2F－3a的表達來抑制多形性膠質母細胞瘤(GBM)的增殖。因此，miR－128的作用也相當于抑癌基因。筆者認為，miR－128也將來可能嘗試用于膠質瘤的靶向治療。

5．miR －9:Chao等［19］用實時定量 PCR 的方法檢測了正常腦組織和膠質瘤組織及膠質瘤細胞系中miR－9的表達。結果發現，相對于正常腦組織，膠質瘤組織及膠質瘤細胞系中的miR－9的表達明顯增加。Kim等則對膠質瘤中的miR－9表達特點做了更為深入的研究，他們通過微陣列技術對膠質母細胞瘤和正常腦組織的miRNA表達譜進行研究，同樣發現膠質母細胞瘤中的miR－9表達相對于正常腦組織明顯增加。于是通過Kim等通過構建過表達及敲低表達miR－9的模型進行進一步的實驗研究，研究發現miR－9能通過下調JAK激酶的表達及抑制STAT3活性來抑制膠質母細胞瘤中間葉細胞的分化。因此，他們認為miR－9是調節神經細胞生長發育及分化的重要分子［20］。

6．miR－451:Godlewski等在一項膠質瘤中葡萄糖含量與miR－451表達關系的研究中發現，在葡萄糖含量高的培養基生長的膠質瘤細胞miR－451表達明顯增高，而且腫瘤細胞生長加快;在葡萄糖含量低的培養基生長的膠質瘤細胞miR－451表達降低，同時腫瘤細胞增殖速率減緩，但是腫瘤細胞遷徙能力和生存能力增強。Godlewski等進一步的實驗研究發現，膠質瘤細胞中miR－451在高糖培養基和低糖培養基中分別以不同方式調控LKB1/AMPK。正常葡萄糖濃度培養基下，miR－451表達上調，抑制了其靶點CAB39的表達，CAB39表達減少導致LKB1活性降低，進而導致AMPK/MAPK通路受抑制，從而導致膠質瘤細胞極性及遷徙能力下降。此外，AMPK/MAPK通路抑制也導致mTOR活性抑制從而引起膠質瘤細胞增殖增加。相反的，低葡萄糖濃度培養基下，miR－451表達下調，進一步的調節機制也相反，最終導致腫瘤細胞增殖速率減緩，但是腫瘤細胞極性、遷徙能力和生存能力增強。另外，Nan等也對膠質瘤中miR－451的表達情況進行了研究，研究發現miR－451在A172、LN229和U251膠質瘤細胞系中表達均下調。隨后他們構建了miR－451高表達的膠質瘤細胞系模型。侵襲實驗發現細胞侵襲能力降低;此外，Akt1、CyclinD1、MMP －2、MMP －9和Bcl－2等蛋白表達隨著miR－451增加而降低，而P27則隨著miR－451增加而升高。基于上述實驗，Nan等人提出miR－451可通過調節PI3K/AKT信號通路影響膠質瘤細胞增殖、侵襲和凋亡。他們認為miR－451在膠質瘤中充當著腫瘤抑制因子的角色。

三、展 望

以上各家的研究報道表明，miRNA的表達水平與膠質瘤的發生發展有著密切的聯系，了解膠質瘤組織中的miRNA，有利于了解膠質瘤的發病機制，此外也為膠質瘤的治療提供了新的研究方向。目前已經知道，miRNA主要通過與靶基因mRNA3'－UTR完全或不完全配對，導致靶標mRNA降解或轉錄后翻譯抑制，因此一個miRNA可有多個靶點。正因如此，miRNA的靶點研究鑒定將是一項很艱巨的工程，miRNA的研究仍任重道遠。此外，鑒于miRNA存在許多靶點這一現象，能否或者如何通過特異性調控miRNA靶點來達到對miRNA最大限度利用，也將會是今后該研究領域的又一難題。總的來說，miRNA在膠質瘤中乃至腫瘤的研究前景是廣闊的，它將會為人類攻克腫瘤這一難題提供新的思路。

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