豬口服免疫F18ac+非產腸毒素大腸桿菌疫苗候選株后小腸免疫細胞的組織形態學特征

董立偉，張江英 （摘譯）

（揚州大學獸醫學院，江蘇 揚州 225009）

1 材料和方法

1.1 細菌株 用于免疫的菌株為F18ac+非產腸毒素大腸桿菌疫苗候選株 2134（O157∶K119∶F18ac），攻毒使用 11-800/1/94 F4ac+ETEC 株（O149∶K91∶F4ac∶987P∶Hly+LT+STb+）。疫苗候選株通過特殊培養程序減毒。

1.2 單克隆抗體 詳見表1。

表1 用于在免疫組織學上顯示豬小腸內淋巴樣和髓樣細胞亞群的豬白細胞CD/SWC抗原特異性單抗

1.3 豬種及試驗設計 試驗所用豬只為15只雜交豬（瑞典長白×約克夏），未接種疫苗的對照組豬在第0d注射生理鹽水，而試驗豬連續 3 d（-2，-1，0）肌內注射2.5mg/kg免疫刺激劑量的左旋咪唑，或在連續3d（-2，-1，0）給予左旋咪唑的基礎上，在第0d通過灌胃接種60mL于TSB內培養的1010CFU/mL F18ac＋非ETEC疫苗候選株2143。7d后，用1010CFU/mL的F4ac＋ETEC株11-800/1/94感染所有試驗豬。第13d，在每組中選取3頭豬施行安樂死，并進行免疫組織學取樣。

1.4 從糞便中分離疫苗株及攻毒株 在注射左旋咪唑前2d開始以直腸拭子對每頭豬在疫苗接種和攻毒后第0d、第7d和13d進行采樣。

1.5 取樣 每組豬中都觀測到了腹瀉現象（盡管強度、持續時間不同，且發生在每組不同編號的豬上），我們按照如下標準在每組挑選3頭豬施行安樂死并取樣：①腹瀉的有無（＋或-）；②腹瀉的程度（輕度為＋，中度為＋＋，＋＋＋為嚴重）。

1.6 免疫組化染色 施行安樂死后，其回腸和空腸的樣本用生物素-抗生物素復合物（ABC）法進行染色。將鼠抗豬CD抗原特異性單抗（見表1）滴加在切片上并在室溫下培養1h。二抗采用生物素化的兔抗鼠IgG。采用標準免疫組織學技術脫水并封片。

1.7 形態測定 利用數字圖像分析（DIA）軟件程序Lucia G定量計數空腸、回腸黏膜內淋巴樣和髓樣細胞亞群的免疫表型。利用t檢驗分析數據得出P＜0.05或更低，認為試驗組和對照組的細胞數之間有顯著差異。

2 結果

2.1 臨床觀測 試驗期間，所有豬均沒有顯示大腸桿菌腸毒血癥的臨床癥狀，具體如表2所示。除了兩頭豬在第8d表現出中度的腹瀉外，所有其他豬在接受攻毒后都沒有產生腹瀉癥狀。由于腹瀉患豬是在第1d或第3d逐漸產生癥狀的，我們認為其不是由接種原因產生的，而推斷為自然感染。

2.2 糞便樣品中的疫苗株及攻毒株 如表3所示，在試驗處理前后通過直腸拭子對分離的E.coli株及其數量進行評估。在試驗的第13 d，從對照組及左旋咪唑＋F18ac＋非ETEC疫苗致敏組的仔豬中分離到了疫苗候選株（O157∶K119∶F18ac），菌落密度分別為1.0×106CFU/mL和8.0×105CFU/mL。從表3我們分析出，99.90%到99.92%的接種疫苗株（在第0d以1010CFU/mL濃度使用）不可能是特異性免疫后14d內增殖的。注射了左旋咪唑的仔豬糞便中并不能分離到這種菌株。然而在試驗的第13d，我們卻可以從這組中2/5的豬上分離出攻毒株（O149∶K91∶F4ac）。我們推測，由于類似的農場株（O8∶K87∶F4ac∶Hly）長期存在于這些豬的胃腸道中，會導致攻毒后菌株更能迅速地通過腸道，因而在其他兩組豬上不能分離出攻毒株。在接種后第14 d和第7d可以分別在兩組豬中分離出少量的疫苗株（0.08%～0.10%）及攻毒株（0.55%）。由此看來，攻毒株通過腸道的速率較疫苗株慢3倍。因此，較合適的免疫辦法是對仔豬自斷奶開始至少連續接種疫苗候選株3d，并在斷奶時以較大劑量接種。

表2 基于糞便黏稠度評分的腹瀉程度

表3 直腸拭子中分離出的E.coli株及其數量

2.3 免疫組化數據 本試驗中我們已經證明了在腸絨毛上皮、腸固有層及回腸派伊爾氏小結中存在大量的CD3＋T細胞。我們還在淋巴濾泡中發現少量該細胞，它們均勻地分布在隱窩及絨毛區域。而幼稚的CD45RA＋淋巴樣細胞在隱窩區域分布的數量則更為龐大。這些細胞在派伊爾氏小結中占優勢的同時，在非淋巴濾泡區域內的數量也很大。CD45RC＋亞型多數位于絨毛固有層及淋巴濾泡間區，在派伊爾氏小結內很少發現。CD21＋B細胞在絨毛及派伊爾氏小結的淋巴濾泡內占據著數量上的優勢。IgA＋漿細胞最常在隱窩區域內可見；具有種屬特異性的SWC3＋巨噬細胞大多分布在上皮絨毛正下方的固有層中，但在隱窩之間也有發現。這些細胞很少分布在回腸的派伊爾氏小結內。

2.4 組織形態學數據 豬空腸和回腸中CD3＋、CD21＋、IgA＋及 SWC3＋淋巴樣和髓樣細胞的數量分別如表4和表5所示。定量的免疫表型分析顯示，注射左旋咪唑的豬與未注射的豬相比，其空腸內CD3＋、CD45RC＋及 SWC3＋細胞有顯著增加（P＜0.05）（見表 4）。而在這些豬的回腸中，僅有CD21＋細胞有顯著增加（P＜0.01）（見表5）。接受左旋咪唑佐劑與試驗疫苗聯合注射的豬，所檢測的小腸兩部分的所有細胞在數量上都有大幅增加（見表4及表5）。

表4 定植于6周齡仔豬空腸黏膜上的淋巴細胞及髓細胞數量（平均數，×10-5）

表5 定植于6周齡仔豬回腸黏膜上的淋巴細胞及髓細胞數量（平均數，×10-5）

表4及表5中列出了僅免疫左旋咪唑的豬及用左旋咪唑＋F18ac＋non-ETEC疫苗候選株聯合免疫的豬其回腸內淋巴樣及髓樣細胞亞群的形態學數據。結果用平均值及每1μm2組織切邊視野內細胞數量的標準偏差表示；每個樣本中的細胞由12個隨機選取的視野（平均范圍為 672387，5μm2）來計數。

3 討論

由于遺傳變異性大及其創造新毒力因子或掩蓋表型特征的能力，某些腸道細菌往往可以逃脫宿主的腸道免疫。在斷奶后一段時間內的應激也會導致仔豬患病。Bertschinger等（2000）曾描述過注射腸道類疫苗的同時飼以低能量日糧這個做法的有效性，研究顯示，給斷奶仔豬口服包含F18菌毛抗原的活疫苗對腸道大腸桿菌感染有很好的保護力。

豬對大腸桿菌造成的腸毒血癥的抵抗力依賴于斷奶時因刺激產生的主動黏膜免疫。目前的研究表明，含F18菌毛抗原的疫苗與左旋咪唑佐劑聯用可以顯著減少病菌的定植及感染產生的臨床癥狀。近期的試驗已經確證了該假說，即左旋咪唑對斷奶仔豬腸系膜淋巴結（MLN）的淋巴細胞及巨噬細胞的免疫刺激效果有助于抵抗大腸桿菌病。Bo?iê等（2003）認為，左旋咪唑使得MLN中參與細胞免疫的免疫細胞擁有更強的增殖能力和活性。Snoeck等（2006）報告，空腸的派伊爾氏小結是豬在接受F4菌毛腸道免疫后，黏膜免疫應答的主要誘導場所。

盡管口服活疫苗似乎較為有效，我們還是有必要對腸黏膜誘導和效應場所內的局部免疫反應做出評估。通過組織形態學分析，我們研究了產生F18ac菌毛抗原的非ETEC株口服免疫對斷奶仔豬小腸黏膜淋巴樣和髓樣細胞定量及分布模式的影響。根據我們的結果，左旋咪唑的非特異性免疫刺激影響，以及它與F18ac＋非ETEC疫苗候選株的協同效應可能為斷奶仔豬提供了有效的、對抗試驗誘發的大腸桿菌腸毒血癥的免疫保護。這些結果顯示，與左旋咪唑聯用的非ETEC疫苗候選株可以高度激發斷奶仔豬回腸及空腸固有層和派伊爾氏小結內細胞的增殖，包括CD3＋T淋巴細胞，幼稚的CD45RA＋及記憶性CD45RC＋淋巴樣細胞，CD21＋B 淋巴細胞，IgA＋漿細胞及 SWC3＋巨噬細胞。

4 結論

將本試驗結果與其他對斷奶仔豬口服免疫含F18菌毛抗原的活疫苗的研究結果進行對比，顯示以左旋咪唑為佐劑的F18ac＋非ETEC疫苗對宿主可能有相加的免疫刺激效應。事實上，對于經左旋咪唑預處理及F18ac＋非ETEC疫苗候選株免疫的斷奶仔豬，這種效應確實可以被所檢測到的腸道免疫細胞亞群表達的增強所證實。這兩種制劑可能在腸道免疫方面起協同作用，為斷奶仔豬對于試驗引起的ETEC感染提供更好的保護。我們的數據顯示，通過對斷奶仔豬進行雙重免疫，使得非ETEC疫苗候選株的同源抗原可以針對性地激活主動黏膜免疫的誘發及效應位點，即回腸派伊爾氏小結和空腸或回腸固有層，從而獲得對豬F4ac＋和（或）F18ac＋ETEC株感染的有效免疫保護。

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