大黃素對白血病K562細胞抑制增殖和誘導凋亡體外研究近況

孟 晉

天津中醫藥大學第一附屬醫院 300193

白血病（leukemia）是一類造血干細胞的惡性克隆性疾病，是最常見的血液系統惡性疾病。我國白血病的發病率約為2.76/10萬，且近年有上升的趨勢。在惡性腫瘤所致的死亡率中，白血病居第6位（男性）和第8位（女性），但在兒童和35歲成人中則居第1位。隨著新的化療藥物的出現和造血干細胞移植技術的不斷提高，白血病患者的治療療效和生存率有了很大的提高。但是仍有30%左右的患者經過治療后不能緩解或者緩解后再復發。造成治療失敗的主要原因是治療過程中出現原發或繼發耐藥（drug resistance），特別是多藥耐藥（multidrug resistance，MDR），導致化療失敗。因此積極尋找新的有效、低毒的化療藥物和化療方案已經成為血液學工作者的重要任務之一。大黃（Rhubarb）為中醫臨床常用中藥，具有瀉下攻積、涼血解毒、清熱利濕等作用。現代藥理研究及臨床應用表明，大黃具有良好的抗病毒、止血、健胃、利膽、瀉下、解熱、鎮痛、抗炎、利尿、降脂、降壓、抗腫瘤及改善腎功能等多種作用。其有效成分之一的大黃素（Emodin，EM）是一種蒽醌類化合物，具有廣泛的作用，如抗腫瘤、抗菌、抗老化及促進胃腸平滑肌運動［1～5］。

1 大黃素對血液系統腫瘤的影響

Kawai等首先發現，大黃素能夠抑制鼠白血病L1210細胞的生長，隨后發現大黃素對多種腫瘤細胞的增殖均有抑制作用［6］。人類紅白血病細胞系K562是由Lozzio等于1975年從1例處于原始細胞危象的慢性髓系白血病患者的胸腔滲出液中建立的，因其具有費城染色體（Ph）及bcr/abl融合基因，常被用于CML的體外研究。現代研究證明很多中藥有不同程度抗腫瘤作用，中藥以其攻補兼施，毒副反應小或無，注意整體的優越性而在腫瘤治療中得到廣泛認可或重視［7］。Mcgahon等［8］研究發現，K562細胞對多種化療藥物誘導的凋亡有很強的抵抗性，這種抗凋亡的機制可能與CML特征性bcr/abl融合基因所表達的P210bcr/abl融合蛋白具有很強的酪氨酸激酶（TK）活性有關［9］。有研究證明，大黃素對小鼠P338白血病有抑制作用。黃綠葉等［10］的實驗證實，大黃素能有效抑制HL60細胞增殖，將細胞阻滯于G0/G1期，誘導其凋亡。連曉嵐等［11］研究發現大黃素能抑制U937細胞增殖。大黃素作用后克隆形成率下降，出現亞二倍體峰及DNA片段化，細胞阻滯在 G0/G1期；bcl－2/bax的比值降低；CPP32活化，這些可能參與了大黃素抑制U937細胞增殖和誘導凋亡的過程。

2 近年來的實驗研究

2.1 大黃素對于K562細胞基因表達的影響 張叢叢［12］通過流式細胞儀檢測，酶標儀檢測caspase3/7活性，RT－PCR檢測bcl－2、NF－κB的表達，發現大黃素能抑制K562細胞生長并具有濃度依賴性，對K562細胞的IC50為51.58μmol/L，大黃素處理后，K562細胞主要表現為S期細胞增多、G0/G1期及G2/M 期細胞減少（P＜0.05）；U937細胞主要表現為G0/G1期細胞增多、G2/M期及S期細胞減少（P＜0.05）。兩種細胞的凋亡率也隨濃度的增加而增加（P＜0.05）。大黃素處理后 K562細胞內的caspase3/7酶活性增加，與對照組相比有顯著性差異（P＜0.05）。經過大黃素處理后K562細胞內的bcl－2、NF－κB的表達均較對照組下調。

胡建達［13］等應用 MTT、DNA片段化分析及TdT酶介導的末端缺失原位標記法檢測大黃素對K562細胞增殖及凋亡的影響；RT－PCR檢測大黃素對K562細胞bcl/abl、mdr－1基因 mRNA表達的影響，免疫印跡實驗法檢測大黃素對K562細胞bcr/abl融合蛋白P210表達的影響。結果發現大黃素能有效抑制K562細胞的增殖作用72h的半數抑制濃度（IC50）為20μmol/L并能誘導其凋亡，隨藥物作用濃度的增加，凋亡率也逐漸上升，大黃素下調K562細胞bcl/abl、mdr－1基因 mRNA 的表達，也下調了K562細胞P210蛋白的表達。

2.2 大黃素對于K562細胞生長周期的影響 鄭志宏［14］等通過采用MTT法、集落形成試驗觀察大黃素對K562增殖的影響、Annexin VFITC/PI法、DNA倍體分析及DNA凝膠電泳法檢測細胞凋亡，Westernblot檢測大黃素作用后不同時間段P210、磷酸化P210、caspase23前體蛋白及PARP表達水平的變化發現，大黃素作用K562細胞后，隨大黃素濃度增大，細胞增殖抑制越明顯，呈劑量依賴性；隨時間的延長，大黃素對K562細胞的抑制率也逐漸升高，呈時間依賴性。大黃素處理K562細胞48h半數抑制濃度（IC50）為38.25μmol/L。大黃素作用K562細胞24h后，隨著藥物濃度的增加，細胞凋亡率主要以早期凋亡為主，并逐漸增加。大黃素作用48h后即可見亞二倍體G1峰（凋亡峰）的出現，凋亡率為9.12%；隨藥物濃度的增大，凋亡率升高，40及80μmol/L大黃素作用的凋亡率分別為25.33%及34.92%。

張旭霞［15］等采用MTT法測定細胞的增殖抑制率，實驗組、對照組和藥物試驗組應用熒光染色法觀察不同濃度大黃素作用后細胞形態的改變判定凋亡效果，DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測細胞內DNA的損傷程度，流式細胞儀分析細胞周期變化，RT－PCR法檢測大黃素作用前、后c－myc mRNA表達水平的變化發現大黃素對K562細胞具有明顯的抑制作用，并呈濃度和時間依賴性（P＜0.01），其96h半數抑制濃度（IC50）約為53.28μmol/L。大黃素作用96h后，熒光顯微鏡下可見細胞核不規則，核碎裂呈新月形改變，DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示，基因組DNA顯現典型的凋亡細胞的梯狀圖譜。流式細胞儀檢測可見大黃素影響細胞周期，細胞阻滯于G0/G1期。RT－PCR法檢測顯示c－myc基因表達減弱（P＜0.01），100μmol/L大黃素作用后表達強度較對照組減少54%。并認為大黃素能有效抑制K562細胞增殖并誘導其凋亡，其作用機制可能是使細胞受阻于G0/G1期而進入凋亡程序，c2myc表達降低可能是大黃素誘導白血病細胞凋亡重要途徑之一。

金丹婷［16］等通過 MTT、流式細胞術、Caspase檢測等方法觀察大黃素對K562細胞的增殖抑制和誘導凋亡作用發現大黃素能顯著抑制K562細胞的增殖，作用24、48、72h后的半數抑制率濃度分別為80、50、40μmol/L；處理組細胞在普通光鏡下可見典型的凋亡形態學改變；Annexin V/PI雙標記法檢測到K562細胞在大黃素的誘導下出現早期凋亡并呈劑量依賴性（P＜0.01）；流式細胞儀結果分析發現，處理組的K562細胞被阻滯于G0/G1期，與對照組相比，凋亡率明顯升高并呈現劑量依賴性（P＜0.01）；大黃素可觸發Caspase－3、8、9的活性增高（P＜0.01）。

2.3 大黃素對K562細胞蛋白合成的影響 鄭志宏［17］應用四甲基偶氮唑藍（MTT）比色法檢測大黃素對K562/Adr細胞增殖的影響；DNA片段化分析、AnnexinⅤ細胞凋亡檢測、DNA倍體分析及TdT酶介導的末端缺失原位標記（TUNEL）法檢測大黃素對K562/Adr細胞凋亡的影響；RT－PCR法檢測大黃素作用前后 K562/Adr細胞c－myc、bcr/abl、mdr－1基因 mRNA 表達的影響；Western blotting法檢測大黃素對K562/Adr細胞c－myc蛋白、bcr/abl融合蛋白P210表達的影響及大黃素作用后HL－60、K562/Adr細胞Akt信號通路蛋白表達水平的變化，發現：（1）大黃素能有效抑制K562/Adr細胞的增殖，作用72h的IC50約為20μmol/L，并能誘導其凋亡，隨藥物作用濃度的增加，凋亡率也漸上升。（2）大黃素下調 K562/Adr細胞c－myc、bcr/abl、mdr－1基因 mRNA 的表達；也下調了 K562/Adr細胞c－myc、P210蛋白的表達。（3）大黃素下調HL－60、K562/Adr細胞 Akt信號通路蛋白 Akt、p－Akt、IκB－α、p－IκB－α、p65、p－p65、mTOR、p－mTOR的表達。發現：（1）大黃素能有效抑制K562/Adr細胞增殖，誘導其凋亡；并可能通過下調c－myc、bcr/abl和mdr－1的表達起作用。（2）Akt信號通路參與了大黃素抑制HL－60、K562/Adr細胞增殖、誘導凋亡的過程。

3 結語

許多研究已證實大黃素具有廣泛的藥理學作用，包括抑制胰酶作用、抗氧化及清除氧自由基、抗炎抑菌及免疫調節作用、肝腎保護作用及抗腫瘤作用等。特別是大黃素具有的抗腫瘤活性使它備受關注，它的抗腫瘤機制也成為研究的熱點。許多對化療藥已不敏感的腫瘤細胞對大黃素還存在一定的敏感度，這就為以后的抗腫瘤治療提供了新的前景，但仍有待進一步深入研究，如體外研究多，體內研究少；誘導凋亡、分化的研究大部分停留在對現象的觀察及個別指標的檢測上；逆轉MDR的研究作用靶點較單一，要與現代細胞與分子生物學結合起來進一步探明其作用機制和靶點。如何從多層次、多學科對其抗腫瘤作用機理進行具體化、客觀化、定性定量的研究，以進一步揭示其奧秘，尚有待醫學科研工作者不斷努力。

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