軟骨形態發生蛋白1誘導瘢痕成纖維細胞表達軟骨表型的實驗研究

馬曉飛 張艷 柴崗 朱明

體內廣泛分布的真皮成纖維細胞（DFs）與軟骨細胞都來源于中胚層間質細胞，與軟骨細胞不同的是，DFs保留了中胚層間質細胞增殖力強的特性，多次傳代后仍能保持強大的增殖力[1]。以往認為DFs屬于終末分化細胞，只能構建真皮組織，不能向其他組織細胞分化。近來研究發現，DFs中存在間充質干細胞，具有向軟骨、骨、脂肪、神經等組織分化的潛能[2-4]。研究發現，在CDMP1作用下，DFs可向軟骨細胞分化并表達軟骨特異性基質[5-6]。Zhao等[7]進一步利用犬DFs進行半月板的自體構建，并成功修復了犬半月板缺損。臨床上大面積燒傷及頭頸部燒傷患者常伴有耳軟骨的燒傷缺損，切取自體肋軟骨進行耳重建創傷較大。DFs的軟骨分化潛能為耳缺損的重建提供了一條新途徑。但是，大面積燒傷患者皮源緊張，無多余皮膚可取，切取正常皮膚亦會增加感染風險，這在一定程度上限制了DFs作為軟骨構建種子細胞的進一步研究和應用。文獻證明，瘢痕成纖維細胞同樣具有強大的體外增殖能力及基質分泌能力，能夠分泌大量膠原及蛋白聚糖，而后者是構成軟骨細胞外基質的主要成分[8-9]。研究表明，瘢痕成纖維細胞具有部分干細胞的特性，在特定條件下能夠表達干細胞相關標志物，并能夠向其他組織細胞轉化，具有類似于DFs樣的分化潛能[10-11]。

因此，本實驗利用CDMP1為誘導因子，探索瘢痕成纖維細胞的軟骨誘導分化潛能，評價其作為軟骨種子細胞的可行性，為瘢痕成纖維細胞用于燒傷后耳軟骨缺損的修復進行初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

CDMP1（Research Diagnostics公司，美國）；Ⅰ型膠原酶（Worthington公司，美國）；DMEM培養液（Gibco 公司，美國）；鼠抗 ColⅠ、ColⅡ、Sox9、Aggrecan抗體（Chemicon公司，美國）；FITC兔抗鼠IgG(Oncogene 公司，美國)；Hoechst(1:500，Sigma 公司，美國)；Trizol(Invitrogen公司，美國)；RT-PCR試劑盒（TaKaRa公司，日本）；封閉緩沖液、鏈抗生物素球蛋白-堿性磷酸酶（Pierce公司，美國）。

恒溫CO2培養箱（Forma公司，美國）；普通臺式離心機、高速冷凍離心機（Heraeus公司，美國）；倒置相差顯微鏡(Nikon公司，日本)；超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；電泳儀(天能科技有限公司)；熱循環儀(Biometra公司，美國)；DU2-640紫外分光光度計、流式細胞儀（Beckman公司，美國）；100 mm培養皿、離心管（FALCON Franklin LakesNT公司，美國）。

1.2 取材與細胞培養

取上海第九人民醫院整復外科手術切除的廢棄瘢痕組織，超凈臺內去除表皮及皮下組織，剩余瘢痕增生部分剪碎移入離心管，加入10倍于組織體積的0.3%的Ⅰ型膠原酶，37℃、3 h、100目細胞濾器過濾后離心，2000 r/min，10min，棄上清，加入 10%FBS的DMEM培養液混浴，接種至100 mm的培養皿。待細胞融合至80%時，以1×104cells/cm2密度傳代，體外擴增至第4代進行誘導培養。

1.3 細胞誘導及分組

配制CDMP1誘導液（2%胎牛血清F-12培養液，CDMP1終濃度為100 ng/mL）。取第4代瘢痕成纖維細胞，無血清培養液孵育24h后更換為誘導液，每3天換液一次，誘導7 d；陰性對照組加入含2%FBS的F-12培養液常規培養；取上海第九人民醫院整復外科患者肋軟骨切除術后部分軟骨組織，分離軟骨細胞常規培養，作為陽性對照組。

1.4 形態觀察

倒置顯微鏡觀察誘導前后細胞形態，Image Plus軟件分析誘導前后細胞長徑與短徑，計算細胞長寬比例。

1.5 免疫熒光檢測

細胞誘導7 d后，4%多聚甲醛固定10min，PBS漂洗，Triton破膜15min，10%羊血清封閉30min，加入鼠抗 ColⅠ、ColⅡ、Sox9、Aggrecan 抗體，4 ℃過夜，PBS漂洗，FITC兔抗鼠IgG孵育30min，PBS漂洗，Hoechst（1:500）染核 2～5min，PBS 漂洗后封片，熒光顯微鏡觀察，胞漿內綠色熒光為陽性表達，胞核為藍色熒光。

1.6 RT-PCR檢測

Trizol提取對照組和實驗組總mRNA，檢測ColⅠ（F-tgttcagctttgtggacctc，R-cttggtctcgtcacagatca；236 bp）、ColⅡ （F-cttgggcacctcgggctcctttag， R-tccccggcactcctggcactgat；510 bp）、Sox9（F-gaacgcacatcaagacggag，R-tctcgttgatttcgctgctc；631 bp）、Aggrecan（F-tcctggaagctcttctcact，R-atgcccaagactaccagtgg；510 bp）的表達，以β-actin（318 bp）作為內參照。根據RTPCR試劑盒操作說明進行逆轉錄和擴增反應，反應條件：94℃變性，55℃退火，35個循環。

1.7 Western blot檢測

收集誘導7 d后的細胞，提取總蛋白。加入等體積2倍的十二烷基硫酸鈉（SDS）上樣緩沖液，β-硫基乙醇 2μL/100μL。 100 ℃沸水變性 10min，冷卻至室溫上樣。聚丙烯酰胺凝膠電泳10 mA，3～4h。電泳結束后90 V、4℃轉膜2 h，4℃封閉過夜。37℃依次加入鼠抗一抗（1:500）生物素化二抗 IgG（1∶500）、鏈抗生物素球蛋白-堿性磷酸酶（1∶3400）進行雜交，逐級雜交放大后滴加顯色底物，顯色后進行結果分析。

1.8 Micromass法誘導與檢測

取第3代瘢痕成纖維細胞，調整細胞至密度為5×107cells/mL，以每滴 15μL 滴至培養皿底部，37 ℃、95%CO2、5%O2培養箱內放置2 h，加入誘導液，誘導及對照組處理同上。誘導7 d后進行免疫組織化學染色和Safranine-O染色，檢測ColⅡ及軟骨基質的表達[12]。

1.9 統計分析

利用 SPSS 11.0 軟件（Chicago，IL）對組間數據進行t檢驗，P<0.05認為差別具有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞誘導前后形態變化

誘導前瘢痕成纖維細胞為長梭形，誘導后長梭形的瘢痕成纖維細胞開始向多角形，不規則形轉變，與軟骨形態類似。對照組未見明顯變化（圖1）。Image Plus軟件分析顯示，誘導后細胞長寬比例為（1.48±0.21）:1，與誘導前的（7.21±1.54）:1 相比，差異有統計學意義（P<0.05）；與正常軟骨細胞的（1.31±0.13）:1 相比，差異無統計學意義（P>0.05）（圖 2）。

2.2 免疫熒光檢測

熒光顯微鏡觀察發現，單層培養的瘢痕成纖維細胞誘導后表達ColⅡ、Sox9和Aggrecan，熒光強度較正常軟骨細胞稍弱；未誘導瘢痕成纖維細胞未見ColⅡ、Sox9和Aggrecan表達。誘導前后瘢痕成纖維細胞均表達ColⅠ，誘導后熒光強度較誘導前稍弱，軟骨細胞未見ColⅠ表達（圖3）。

2.3 RT-PCR檢測

CDMP1誘導7 d后，RT-PCR檢測到 ColⅡ、Sox9和Aggrecan擴增產物，擴增結果與正常軟骨細胞相一致；未誘導組未見ColⅡ和Sox9軟骨相關標志物的擴增結果，Aggrecan檢測到少量擴增產物；誘導組與未誘導組均出現ColⅠ擴增產物，正常軟骨細胞未檢測到ColⅠ擴增產物（圖4）。

2.4 Western blot檢測

瘢痕成纖維細胞經誘導7 d后，Western blot結果顯示ColⅡ、Sox9和Aggrecan等軟骨特異蛋白表達，誘導后結果與正常軟骨細胞相一致，未誘導組未見ColⅡ和Sox9特異蛋白表達，Aggrecan弱表達。誘導組與未誘導組均出現ColⅠ表達，正常軟骨細胞未檢測到ColⅠ表達（圖5）。

2.5 Micromass培養法誘導前后比較

將瘢痕成纖維細胞進行Micromass誘導7 d。HE染色顯示整個細胞團塊以纖維性組織為主，團塊外緣部分細胞出現特征性軟骨陷窩。免疫組織化學檢測ColⅡ表達情況，發現Micromass團塊部分區域出現黃褐色，提示Ⅱ型膠原的表達。Safranine-O染色結果顯示細胞團塊大部分區域出現紅染，外側顏色深于中央，提示有軟骨基質的沉積（圖6）。

圖1 各組細胞組織學觀察（倒置相差顯微鏡，100×）Fig.1 The histological observation(Inverted phase contrast microscope,100×)

圖2 各組細胞長寬比例Fig.2 Cell length/width ratio in each group

圖3 免疫熒光檢測各組細胞ColⅠ、ColⅡ、Sox9及Aggrecan的表達（免疫熒光顯微鏡，100×）Fig.3 The expression of ColⅠ,colⅡ,Sox9 and Aggrecan of each group detected by immunofluorescence(Immunofluorescence Microscopy,100×)

圖4 RT-PCR檢測各組細胞ColⅠ、ColⅡ、Sox9及Aggrecan的表達Fig.4 The expression of ColⅠ,colⅡ,Sox9 and Aggrecan of each group detected by RT-PCR

圖5 Western blot檢測各組細胞 ColⅠ、ColⅡ、Sox9 及Aggrecan的表達Fig.5 The expression of ColⅠ,colⅡ,Sox9 and Aggrecan of each group detected by Western blot

圖6 Micromass誘導7 d后各組HE染色、免疫組織化學染色及Safranine-O染色結果Fig.6 The histological observation of each group after 7 days micromass culture by HE staining,immunohistochemistry and Safranine-O staining

3 討論

軟骨形態發生蛋白（Cartilage-derived morphogenetic protein 1，CDMP1）[13]是骨形態發生蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）家族中的一類特異性生長因子，是與軟骨形態發生和發育最為相關的一類生長因子。CDMP1主要通過調節間質前體細胞的分化，參與正常軟骨組織的生長，并促進軟骨損傷的修復過程，在軟骨的分化發育中起重要調控作用。研究表明，CDMP1能夠誘導間充質干細胞向軟骨表型分化，并表達特異性軟骨基質[14]，是干細胞定向譜系分化的一種高效誘導劑。

真皮成纖維細胞與軟骨細胞都來源于中胚層間質細胞。與軟骨細胞不同的是，DFs保留了中胚層間質細胞增殖力強的特性，多次傳代后仍能保持強大的增殖力，是體內最大的“種子庫”。研究表明，DFs并非完全分化的終末體細胞，在特定條件下仍具有向其他譜系細胞分化的能力。Han等[15]采用基因轉染的方法將4種基因轉入牛的DFs，轉染后發現DFs具有干細胞的多向分化潛能，能夠向骨、脂肪、軟骨、神經等多類型組織細胞分化。Kunihiko等[16]取鼠DFs采用基因轉染后進行軟骨定向誘導，發現DFs即使在未轉變為IPS細胞的前提下仍能夠向軟骨細胞分化，并表達軟骨特異標志物，推測DFs本身可能具有干細胞潛能。CDMP1可直接誘導DFs向軟骨細胞轉化，并能夠在體內成功構建半月板軟骨，實現半月板的生物修復，證明了DFs具有軟骨分化潛能。

病理性瘢痕的形成是成纖維細胞過度增殖和細胞外基質過度沉積的過程。在一系列細胞生長因子的調控下，瘢痕成纖維細胞增殖力活躍，基質分泌能力旺盛，大量合成膠原及蛋白聚糖等物質，導致瘢痕過度增生。相對于DFs而言，瘢痕成纖維細胞保持了體外培養的高度增殖力，并具有比DFs更強大的分泌能力，能夠分泌軟骨特異性標志物Aggrecan。特別是對于大面積燒傷伴有耳軟骨缺損患者，因皮源緊張導致無皮可取，瘢痕成纖維細胞成為DFs的最佳替代種子細胞。研究表明，瘢痕成纖維細胞不僅具有強大的增殖力，同時具有間充質干細胞的活性，在特定條件下可能具有向其他譜系細胞分化的潛能。Yang等[10]提取瘢痕疙瘩中的成纖維細胞，在特定誘導條件下發現瘢痕成纖維細胞具有干細胞樣分化潛能，能夠表達神經膠質細胞相關標志物，并能夠向神經細胞分化誘導，有望成為一種潛在的組織修復種子細胞。Moon等[11]從頭皮瘢痕中分離瘢痕成纖維細胞，采用各種誘導體系對瘢痕成纖維細胞進行誘導培養，結果顯示瘢痕成纖維細胞能夠表達間充質干細胞的標志物 CD13、CD29、CD44、CD90、Fibronectin及Vimentin等，并能夠向骨組織細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、肌腱細胞及上皮細胞等方向分化；在向神經組織分化過程中，瘢痕成纖維細胞在誘導后具有神經干細胞的特性，表達神經元干細胞的標志物，并向神經膠質細胞分化，證明了瘢痕成纖維細胞具有多向分化潛能，可能成為多組織修復的替代細胞。ColⅡ和Aggrecan是目前已證明的軟骨細胞最特異的標記物[17]，瘢痕成纖維細胞本身并不表達ColⅡ。在本實驗的誘導體系下，單層培養的瘢痕成纖維細胞經CDMP1誘導7 d后，細胞形態由長梭形向多角形轉變，細胞長寬比例降低，與軟骨細胞差異無統計意義。免疫熒光、RT-PCR、Western blot等均證實誘導后的瘢痕成纖維細胞表達ColⅡ，且誘導后瘢痕成纖維細胞Aggrecan表達增強，證實瘢痕成纖維細胞向軟骨細胞的轉分化。同時，誘導后瘢痕成纖維細胞出現Sox9的表達，Sox9是調節軟骨細胞分化與軟骨基質合成的重要轉錄調控因子，提示CDMP1可能通過調控上述基因的作用誘導瘢痕成纖維細胞向軟骨細胞分化。為進一步證實上述研究結果，我們又將瘢痕成纖維細胞進行Micromass法培養誘導，誘導7 d后發現，Micromass團塊部分瘢痕成纖維細胞出現軟骨陷窩結構，由于團塊外側對于培養液接觸的優勢性，因此出現軟骨陷窩結構的瘢痕成纖維細胞多聚集在外側。免疫組織化學染色顯示，細胞團塊偏外側區域出現黃褐色顯色，表明瘢痕成纖維細胞ColⅡ的表達，顯色區域與出現軟骨陷窩結構區域基本一致。Safranine-O染色示細胞團塊出現大片紅染，表明瘢痕成纖維細胞內外有軟骨基質的沉積，進一步證實了瘢痕成纖維細胞向軟骨細胞的分化潛能。

本實驗證明，在CDMP1誘導下，瘢痕成纖維細胞在單層培養和Micromass培養條件下，均能向軟骨細胞表型分化，表達軟骨特異性指標，并合成軟骨基質，證明瘢痕成纖維細胞具有軟骨分化潛能，有望作為燒傷后耳缺損修復的軟骨種子細胞。但是，誘導分化后軟骨表型的維持時間、誘導體系的優化、誘導分化機制，及組織工程化耳軟骨構建等問題還需進一步研究。

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