結核病的細胞免疫研究進展

蔣 毅 萬康林 闞 飚

結核病一直是人們關注的全球性健康問題。目前，全球已有20億人感染結核菌，活動性結核患者達1500萬，每年新發結核患者達800～1000萬，有180萬人因結核病死亡。結核病的感染、發生、發展及轉歸都依賴于機體細胞免疫反應的不同作用機制。本文就近年來結核桿菌的細胞免疫研究做一綜述，以期為結核病的預防、診斷和治療提供參考。

一、細胞免疫反應的開始

機體在感染結核菌后引起細胞免疫已研究多年。最近的分析表明，在原發感染5天后，全身性感染刺激的淋巴細胞可以通過轉移產生調節保護作用。這種保護性策略最初在L3T4(CD4)T細胞中發現，然后在Ly2(CD8)T細胞中出現，然后兩種細胞都會對氣溶膠產生保護性作用。研究表明在感染氣溶膠后的25天內起保護性作用的T細胞為即為效應T細胞。Chackerian等［1］研究表明結核菌感染肺部后，引流淋巴結是產生獲得性細胞免疫反應的最初部位，進而引發全身反應，但是卻沒有直接闡述初始T細胞反應。利用T細胞受體轉基因小鼠的研究進一步證實了Chackerian等的結果即抗原特異性T細胞最初是在肺的引流淋巴結激活的，并且這個激活要遲滯一段時間。因此，不論以何種方式激活的初始T細胞反應，都是于氣溶膠感染9天后發生，而最初的部位是引流淋巴結。在所有研究中，產生細胞免疫應答的時間與活菌到達淋巴結的時間是一致的，這表明細菌的播散對于細胞免疫應答起著重要作用。

那為何播散如此之慢呢?研究表明結核菌到達肺部定居于肺實質而不是氣管的黏膜組織，而這兩種細胞在表型和功能上也有明顯的不同。有關低劑量的活菌進行感染后的情況還沒有確定。然而，在9天后結核菌大量增加，最初在引流淋巴結，然后進入淋巴［1～3］。如果在這之前，即使使用可動員和感染細胞至淋巴結的外部炎性介質，也不能加速結核菌的播散及免疫反應的啟動［2］。大于10倍的劑量可加速播散，但也僅僅是提前了1～2天。這說明結核菌的定居部位也是產生細胞免疫反應延遲的重要作用之一［3］。

樹突狀細胞(DC)參與的結核菌的遷移被認為對應答的啟動有著重要作用。因此，這些細胞在氣管的不同功能和不同部位決定應答的動力學。結核菌感染的DC通過氣管到達肺部可以遷移到引流淋巴結并進而引起細胞免疫應答［4～6］。這并不能說明這些細胞是定居在肺泡內，而且我們也不能確定這些細胞代表了所有在這一環境的所有DC的功能。氣管內的DC是位于黏膜的環境中并遷移至引流淋巴結。相反，在肺泡組織中的DC是處于一個有表面活性劑蛋白和肺泡巨噬細胞的可調節的環境中，這就限制了這些細胞對感染進行應答并遷移。結核菌播散的延遲和細胞應答的啟動可能因此反應出肺泡巨噬細胞(包括吞噬細胞和DC)的感染，而這些細胞可抵抗遷移和炎癥的發展。這一抵抗作用對于將肺泡作為一進行對抗炎性作用的空氣交換的表面起著重要作用。結核菌引起的獲得性細胞反應的慢啟動可能與結核菌的生長緩慢和肺泡組織的相對免疫豁免特性有關。

二、細胞免疫應答的發展

目前，DC被認為是最有效的T細胞免疫反應啟動者。它們不僅產生抗原特異性刺激，還產生二級和三級的信號刺激，從而引起效應性T細胞產生有效作用。大量研究是有關結核菌感染對DC功能的影響。實際上，經典的表現是未成熟DC可以吞噬有害顆粒并成為有效抗原呈遞細胞，而后者使用BCG作為成熟佐劑。然而最近有研究表明在體內被感染的DC比等量的未感染DC刺激抗原特異的T細胞效率更低［7］。

我們還不能確定T細胞反應的啟動是由肺部來源的結核菌感染的DC間直接相互作用引起的。然而，在抗原刺激的DC通過氣管注射到肺部的模型中，這些細胞遷移到引流淋巴結和啟動T細胞反應的能力更強［4～6］。此外，IL－12p40促進這種遷移，IL－10限制它［4，6，8］。這些數據都表明簡單的暴露于結核菌并不足以限制感染的DC引起T細胞反應。被感染的肺部DC從肺遷移至引流淋巴結，但這種遷移在感染發生的前14天很難看到［7］。盡管我們不能確定進入淋巴結的確切的菌株數量，當T細胞反應啟動時結核菌是在淋巴結中，因此結核菌可阻止T細胞反應。更為重要的是初始T細胞活化后增殖，上調CD44，下調CD62L，然后以預期的動力學在肺部聚集［3］。這表明結核菌在淋巴結的出現并不影響初始T細胞反應。然而，我們并不知道新的活化T細胞的擴增和存活是最佳的。我們觀察到結核菌感染淋巴結后會導致T細胞區的化學動力學的改變，而這也影響新抗原特異性反應的產生［9，10］。這些都表明結核菌在淋巴結的感染可能影響初始T細胞活化。

細胞一旦活化，在感染后的15～18天它們就遷移到主要的感染部位［3］。我們還不能確定這種募集是否延遲和它是由抗原或炎癥決定的。新的實時成像技術使我們更了解影響調節炎性部位產生的因素。有篇文章報道的是有關T細胞和巨噬細胞如何在肉芽腫中相互作用。在這篇報道中，使用BCG進行系統感染，肝巨噬細胞吞噬結核菌，遷移至該部位的未感染巨噬細胞和從血中的單核細胞形成肉芽腫［11］。在用實時成像技術研究斑馬魚的模型的研究同樣提供了結核菌感染后產生細胞免疫反應的動力學和發展及轉歸，尤其是經基因修飾的結核菌和宿主的模型使我們更了解影響肉芽腫的發展的因素。

三、效應T細胞的新子集

我們知道淋巴細胞聚集在炎性損傷部位并可能通過活化感染的吞噬細胞調節保護性免疫，但仍不能完全確定它們在體內的功能。實際上，大家都認為CD4 T細胞產生IFN－γ，這是產生保護性免疫需要的，但這種假設是建立在大量的相關性研究的基礎上的。有研究表明產生IFN－γ的CD4T細胞的到來與結核菌的增長停止相關［12～15］，而失去了CD4T細胞更易受到結核菌的損害。然而，我們已了解到CD4 T細胞對結核菌增長的保護性作用，我們至今都不能完全確定它們調節保護的能力和它們調節免疫的機制。很明顯，不同的CD4 T細胞效應子集存在著，包括早期的活化細胞產生IL－2，產生IFN－γ的細胞，表達IL－2、IFN和TNF的多功能細胞，而這些多功能細胞又與免疫保護相關［16］。此外，已在小鼠和人中檢測到細胞毒性CD4 T細胞［12，17］。多功能細胞在結核病人、高發病率地區的人群和預防接種過的嬰幼兒中常見［18～20］。所有效應性細胞的發展和功能依賴于在引流淋巴結的DC成熟并促進這些細胞有效的存活。這種成熟需要抗原在MHC內的表達，共刺激分子和促進T細胞極化的必須的細胞因子。IL－12p70在產生IFN－γ的細胞中的作用已經被廣泛的論述到。然而，產生和維持多功能和細胞毒性淋巴細胞的環境還沒有完全被確定。

最近研究者們已發現了功能性T細胞的新子集，如可以產生IL－17和IL－22的細胞，這些細胞已經在感染結核菌的小鼠和人體內觀察到。但我們對其在結核中的保護性作用還不是很了解。然而，最近的研究表明即使是在已經確定好的小鼠模型中我們仍然可以了解到對結核的細胞免疫反應。在進行氣溶膠感染后的小鼠，其體內已誘導出可產生IL－17的抗原特異細胞，這些細胞和大部分IL－17在肺部的反應都依賴于IL－23的出現。γδT細胞是IL－17的來源，在鼻內大量注入BCG后很快就會產生這種細胞因子。在小鼠模型中IL－17的一大部分的反應是在γδT細胞中。當IL－17在高劑量的刺激被阻斷后，中性粒細胞募集被阻止，這就可能影響后來炎癥的發展。在缺少IL－23的小鼠中，大多是IL－17引起的反應，這對早期的炎性反應影響不大。這些細胞的作用是保護還是損害還不能確定，但當用結核抗原反復刺激結核菌感染的動物后，傷口就發生壞死并包含大量的粒細胞。這些數據都說明了慢性抗原暴露的炎性反應是依賴于IL－23和IL－17的。此外，在小鼠體內對結核菌感染產生的細胞反應中，這兩種細胞因子可能是有雙重作用的，但在人類中的情況還未可知。目前，已在感染結核的人體內檢測到可產生IL－17和IL－22的CD4抗原特異細胞，其中IL－22僅在肺內發現［19］。

四、人體內的細胞免疫反應

對細胞應答的分析表明感染和患病的個體表達了大量的多功能細胞［18］。最近在歐洲的人群研究報道了結核菌特異的IL－17特異反應很弱而IL－17對真菌的感染卻產生了較強的應答。相反的，在對南非人群的研究中，結核菌特異的IL－17和IL－23T細胞均可在暴露和感染的個體檢測到，但在感染人群的外周血中此細胞的濃度較低［19］。盡管在外周血中的低濃度，IL－22可以在病人的肺泡盥洗液中檢測到，這說明產生IL－22的細胞在病人的肺部是起作用的［19］。在最近的一項研究中用Ag85/HLA－A* 0201五聚物來估計結核病患兒在藥物治療前后的抗原特異性細胞的頻率，這些患兒在血中抗原特異性CD8T細胞頻率較低，而在治療后會提高，可能是由于治療后減少了對T細胞活性的抑制或是因為對肺部病變的處理和因此從血中募集抗原特異的細胞到損害部位也降低了。更為有意義的是，在治療前，循環中的抗原特異的細胞具有較低的細胞因子水平和溶細胞作用。另一項研究發現在治療之初抗原特異的產生IFN－γ的細胞高于產生IL－2的細胞，在治療28個月后，前者逐漸降低而主要表現為對產生IL－2細胞的免疫應答。進一步的研究應該是對人體內抗原特異的細胞應答的動力學和性質的研究。

南非對新生兒大量的卡介苗接種使得我們可以對新生兒中BCG誘導產生特異的細胞免疫反應進行篩查。在最近的一項研究中，從BCG接種后的新生兒體內的細胞在體外用BCG重新刺激，其細胞免疫應答用流式細胞儀進行檢測分析。重要的是，產生IL－4和IL－10的CD4T細胞低水平表達，而由活化的CD4T細胞會單獨或同時產生IFN－γ，IL－2和TNF?；罨腃D8T細胞也很少，但一旦出現就表現為IL－2和(或)IFN－γ陽性。需要說明的是，許多反應性T細胞并不產生IFN－γ。因此，許多反應性細胞的效應表型還需進一步研究。大多數產生IFN－γ的細胞都具有效應細胞表型，而那些只表達IL－2的細胞是中央記憶表型［20］。

目前對暴露個體產生抗原的確定引起了極大關注。在一項研究中采用免疫優勢抗原的合成多肽序列法，表現為大量的CD8T細胞克隆的抗原特異性，同時確定了新的抗原表位。另一研究使用結核菌和BCG的基因差異區并對病人和接種健康個體的肽特異性反應進行比較。在此研究中，兩組人群對RD1區的肽都產生了應答，外周血單核細胞對RD12，RD13和RD15產生IL－10細胞免疫反應，這表明不同的RD區的抗原與不同的細胞免疫相關。這類研究使我們更了解了人體對結核菌的T細胞反應的特異性。

綜上所述，近年來我們對結核菌感染的細胞免疫反應的研究有了很大的提高，但我們始終不能確定介導免疫發生和接種疫苗而產生的獲得性細胞免疫的類型，這就大大限制了新疫苗的研制。由于不能將疫苗直接進行人體試驗，我們也不能得到確定的保護性相關的證據。然而我們相信隨著現代分子生物學技術的發展、基因組學和蛋白組學研究的深入，越來越多的細胞因子在結核免疫中的作用將被人們清楚認識，可誘導長效保護性免疫應答的疫苗將不斷問世，為對抗結核病這一頑疾帶來新的希望。

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