新疆南疆地區奶牛乳腺炎性金黃色葡萄球菌生物膜形成及其相關基因的檢測

李延榮 陳 偉，2

(1 新疆兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，新疆阿拉爾 843300)

(2 新疆兵團塔里木畜牧科技重點實驗室/塔里木大學動物科學學院，新疆阿拉爾 843300)

奶牛乳腺炎是危害奶牛業發展的重要疾病之一，流行病學調查表明使用抗生素治療其治愈率在0～80%之間不等，其中最難治療的是由金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)引起的感染。而近年來的研究表明［1］，金黃色葡萄球菌形成的生物膜具有高度的耐藥性并能逃避免疫系統的攻擊，其感染易慢性化并難于控制。因此研究奶牛乳腺炎的病原菌之一——金黃色葡萄球菌生物膜形成狀況及機制尤為重要。本研究檢測了分離自本地區奶牛場的金黃色葡萄球菌其生物膜形成狀況以及可能在生物膜形成的不同階段發揮作用的相關基因的分布情況，為該地區金黃色葡萄球菌感染引起的奶牛乳腺炎防制提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

PCR儀(Bio－Rad)、移液槍(Eppendorf)、恒溫培養箱(上海)、水浴鍋(金怡)、96孔板(Labphil Biotechnology)、電熱恒溫干燥箱(DHG－9031A)等。

1.2 實驗藥品

胰蛋白胨大豆肉湯(TSB培養基，BactoTM)、PCR相關試劑均購自東盛生物公司，實驗所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 實驗菌株

表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)ATCC35984(BF+)由上海復旦大學醫學院贈送，其它實驗菌株均為本實驗室分離鑒定所得。

1.4 金黃色葡萄球菌生物膜形成能力的檢測

根據任曉鏷等［2］的方法，即將富集培養過夜的菌液按1:100比例吸取20 μL菌液接種至2 mL TSB液體培養基中，振蕩混勻后，吸取200 μL至96孔細胞培養板中，每個實驗菌株接種4孔，同時設立陽性對照(ATCC 35984)及空白對照(不加菌液的TSB培養基)各4孔。37℃恒溫靜置培養24 h后，將培養液輕輕拍出，無菌水洗去未粘附的懸浮菌體及培養液，該步驟重復4次。56℃烘干固定1 h。用50 μL 0.5%結晶紫染液浸染5 min，流水沖洗多余染液，直至沖洗流出的水為無色，37℃晾干。用酶標儀測定490 nm處的OD值。所有生物膜形成檢測實驗均在不同時間重復3次。

1.5 金黃色葡萄球菌生物膜形成相關基因檢測

1.5.1 ica 基因的檢測

［3］中icaA基因的引物序列合成引物，見表1

表1 ica依賴型生物膜形成相關基因

PCR反應條件:

預變性95℃，5 min;變性 95℃，60 s;退火50℃，30 s;延伸72℃，30 s;36個循環;末次循環后72℃，10 min;電泳檢測。

1.5.2 非ica基因的檢測

參考相關文獻［4，5］選擇7個與金黃色葡萄球菌生物膜形成有關的基因，并設計引物，見表2

PCR反應條件:

預變性95℃，5 min;變性 95℃，60 s;退火45℃，30 s;延伸72℃，30 s;36個循環;末次循環后72℃，10 min;電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌生物膜形成的表型檢測

本實驗采用微量板半定量法對患有隱性乳房炎的奶牛乳樣中分離得到的金黃色葡萄球菌進行生物膜形成的表型檢測，檢測結果表明，112株金黃色葡萄球菌中，有31株菌可形成不同強度的生物膜，約占檢測菌株總數的27%。說明在當地奶牛場能形成生物膜的乳房炎金黃色葡萄球菌已經占有了一定的比例，這種生物膜形成菌株的出現，為臨床治療奶牛乳房炎提出了新的要求。

2.2 ica基因座在實驗菌株中的分布情況

本實驗對112株金黃色葡萄球菌臨床分離株進行icaA基因的PCR檢測，其中含有icaA基因的菌株15株，占檢測菌株總數的13.4%(15/112)。

2.3 ica非依賴性生物膜形成相關基因的檢測結果

本實驗對分離獲得的112株金黃色葡萄球菌，分別進行 sarA、ccp、luxS、sigB、agrC、bap、tcaR 7 個基因的PCR檢測，檢測結果表明，112株金黃色葡萄球菌分離株上述7種基因的分布存在較大差異，其生物膜形成能力也存在差別，具體結果見表3。其中34株擴增出luxS基因的菌株和36株擴增出sarA基因的菌株，各有6株能形成不同強度的生物膜，分別占基因擴增陽性菌株數的18%和17%，而其中生物膜形成能力較強的菌株5－100－1和5－128－2都含有ica及ccp基因，說明菌株生物膜形成能力可能與ica及ccp基因的產物有關。

表3 非ica依賴型各個基因的檢測結果

3 討論

3.1 ica基因在細菌生物膜形成中的作用

細菌生物膜(biofilm formation，BF)的形成主要經過四個階段:細菌的初始黏附，細菌的聚集，細菌生物膜的成熟和生物膜細菌的釋放。而根據其在初始粘附階段依賴的胞外多聚物是以多糖為主還是以其它物質，如蛋白質為主，可將細菌生物膜形成機制分為 ica依賴型和 ica非依賴型兩種［4，6］。ica基因座以操縱子的形式存在于細菌染色體上，主要包括icaA、icaD、icaB和icaC以及位于icaA上游的阻遏基因icaR［5］，icaADBC介導產生的胞外多糖是ica依賴性生物膜形成初始粘附階段的主要功能性物質，而其中含有的II型多糖PIA(polysac charide－intercellular adhesin)是生物膜的主要組成成份，也是細胞成簇的主要功能性物質［7］。本研究檢測的菌株中，含有icaA基因的有15株，生物膜檢測實驗結果表明，生物膜陽性菌株中含有icaA基因的菌株僅有2株，即不是所有含ica基因的金葡菌都能形成生物膜，且有部分生物膜陽性菌株并不含有ica基因。

對于ica基因座在菌株中的分布與生物膜陽性菌株的相關性，劉慶中等研究表明，檢測含有ica基因座的菌株與生物膜表型檢測的陽性菌株結果并不一致，即檢測含有ica基因座的菌株其生物膜表型檢測呈陰性［8］。本實驗的研究結果也證實了這一觀點。產生這一現象的原因可能是ica基因的表達受環境因素以及生物膜非ica依賴性機制導致的結果。同時，本實驗結果也表明該地區奶牛乳腺炎性金黃色葡萄球菌生物膜形成存在ica依賴性及ica非依賴性兩種形成機制［4］，而任曉鏷等研究者檢測同一地區的表皮葡萄球菌中未檢測到ica基因［6］，說明本地區表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌生物膜的形成機制存在差異。

3.2 群感效應(quorum sensing，QS)相關基因在細菌生物膜形成中的作用

群感效應是指細菌能夠分泌特定的信號分子并感應它的濃度，當信號分子濃度達到閾值時，可以調控生物膜形成和其它生物學功能，如毒力因子的分泌等。在葡萄球菌中與群感效應有關的基因有agr、luxS、sarA、sigB 等基因。

群感效應附屬基因調節子(accessory gene regulator，agr)系統是葡萄球菌生物膜形成的重要調節系統，即agr系統。agr系統組成成分之一AgrC具有組氨酸蛋白激酶活性，它與另一個組分AgrA共同構成了金黃色葡萄球菌雙組成信號傳遞系統。agr系統激活后，能夠通過不同途徑調節一系列相關基因的表達［9，10］。本實驗對 agrC 基因進行檢測，檢測結果表明有3株菌含有agrC基因，而這3株菌恰恰為生物膜形成陰性菌株。有學者已經在表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌中發現agr系統可降低細菌對聚合物固相表面的粘附能力，負調控生物膜的形成［11，12］。本研究的結果可能支持了這一結論。

在表皮葡萄球菌中luxS主要通過調節ica基因座的轉錄及PIA的產生，達到抑制生物膜形成的作用。但在金黃色葡萄球菌中，該基因是否對金黃色葡萄球菌的生物膜形成有關尚不明確［9］。本實驗室分離得到的金黃色葡萄球菌中該基因存在于其中的34株菌中，而只有6株生物膜陽性菌株中含有該基因。Kuehl等研究表明抑制金黃色葡萄球菌luxS的表達，可促進生物膜的形成，說明luxS對生物膜形成能力起負調控作用。而本研究的實驗結果表明82%含有該基因的菌株不能形成生物膜，也驗證了這一結論。

sarA基因是葡萄球菌附屬調節因子A(staphylococcal accessory regulator A，sarA)，是另一個群感效應系統的成員，編碼SarA蛋白。有研究發現表皮葡萄球菌與金黃色葡萄球菌中sarA基因對PIA的合成是必須的。在金黃色葡萄球菌中，sarA還可以正調控生物膜形成相關蛋白Bap的表達，表明該基因參與葡萄球菌生物膜形成的ica依賴性與ica非依賴性兩條途徑［4］。本實驗在112株檢測菌株中，含有sarA基因的菌株36株，而在生物膜陽性菌株中檢測到含有該基因的菌株有6株，同時還含有ica基因的有2株。這一結果說明本地區分離獲得的奶牛乳房炎性金黃色葡萄球菌其sarA基因可能參與了生物膜形成的ica依賴性與ica非依賴性兩條途徑。

sigB基因是調控葡萄球菌生物膜形成及毒素因子表達的全局調節子，因此其功能比較復雜。在金黃色葡萄球菌中該基因可對agr及sar基因進行調控，從而影響生物膜的形成。本實驗分離得到的臨床分離株中，含有該基因的菌株38株，生物膜陽性菌株為4株，其中2株菌同時含有sarA基因及sigB基因。但sigB基因在這些菌中的作用需進一步驗證。

3.3 其它基因在葡萄球菌生物膜形成中的作用

bap基因，即生物膜相關蛋白基因(biofilm－associated protein，bap)編碼金黃色葡萄球菌表面蛋白Bap。Bap蛋白在BF形成的不同階段，其表達量呈周期性變化，以促進黏附或促進釋放。本實驗室分離得到的金黃色葡萄球菌含有bap基因的菌株17株，而其中僅有1株為生物膜陽性菌株，同時該菌株含有sarA基因，說明bap基因表達可能受sarA基因的正調控［4，9］。

ccp基因主要是在葡萄球菌生物膜形成的聚集及細胞成叢階段發揮作用，敲除該基因則不能形成成熟的生物膜，但不影響生物膜形成過程中的初始粘附階段。本實驗分離得到含ccp基因金黃色葡萄球菌51株，31株生物膜陽性菌株中有7株菌含有該基因。生物膜形成能力較強的2株菌同時含有ica及ccp基因，而另有2株生物膜形成弱陽性菌株只含有ccp基因而不含ica基因。說明ccp基因與ica基因的表達產物可能相互協同，共同促進生物膜的形成。

tcaR基因在一般情況下，會與特定的DNA序列相互作用以抑制生物膜形成，當抗生素，如替考拉寧存在時，能與tcaR結合使tcaR的結構發生變化，從而失去活性，使生物膜形成及抗藥性基因正常啟動。本實驗室分離得到的12株金黃色葡萄球菌含有該基因，其中11株為生物膜形成陰性菌株，可能與tcaR基因對生物膜的負調控有關。

本實驗對當地奶牛乳腺炎性金黃色葡萄球菌生物膜形成表型和相關基因進行了檢測。從本實驗的結果可知，當地分離獲得的金黃色葡萄球菌其生物膜形成同時存在ica依賴性與ica非依賴性兩條途徑，且所選擇的8個與生物膜形成有關的基因在本地區奶牛乳腺炎性金黃色葡萄球菌生物膜形成菌株中均有不同比例的分布。該研究結果說明本地區奶牛乳腺炎性金黃色葡萄球菌生物膜形成機制復雜，為防制葡萄球菌生物膜引起的相關感染奠定理論基礎。

參考文獻

［1］李方去，楊錦紅，王慧燕，等.兩種臨床標本中耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌生物膜形成能力的檢測與其耐藥特征的研究［J］.中國微生態學雜志，2012，24(6):531－534.

［2］任曉鏷，陳偉，張利莉.不同理化因素對表皮葡萄球菌生物膜形成的影響［J］.西北農業學報，2011，20(12):1－5.

［3］Ciftci A，Findik A，Onuk E E，et al.Detection of methicillin－resistanceandslimefactorproductionof Staphylococcus aureus in bovine mastitis［J］.Braz J Microbiol，2009，40(2):254 － 261.

［4］陳偉.奶牛乳房炎葡萄球菌生物被膜形成機制研究進展［J］.中國預防獸醫學報，2009，31(12):996 －1000.

［5］孫鳳軍，枉前，夏培元.臨床分離金黃色葡萄球菌生物膜相關基因的 PCR分析［J］.第三軍醫大學學報，2009，31(15):1447 －1449.

［6］任曉鏷，陳偉，張利莉.新疆南疆地區奶牛乳房炎性表皮葡萄球菌生物膜形成及其相關基因的檢測［J］.塔里木大學學報，2011，23(3):14 －18.

［7］Melchior M B，Vaarkamp H，Fink － Gremmels J.Biofilms:a role in recurrent mastitis infections［J］.Vet J，2006，171(3):398 －407.

［8］劉慶中，韓立中，孫景勇，等.高水平莫匹羅星耐藥MRSA體外生物膜形成能力及相關基因檢測［J］.中國感染與化療雜志，2011，11(4):276 －280.

［9］周學東，施文元.微生物生物膜與感染［M］.北京:人民衛生出版社，2012.

［10］張東偉，溫紅俠，陳一強.金黃色葡萄球菌生物被膜形成調控機制與治療策略進展［J］.國際呼吸雜志，2009，29(20):1273 －1276.

［11］Vuong C，Saenz H L，Gotz F，et al.Impact of the agr quorum－sensing system on adherence to polystyrene in Staphylococcus aureus［J］.J Infect Dis，2000，182(6):1688－1693.

［12］Vuong C，Kocianova S，Yao Y，et al.Increased colonization of indwelling medical devices by quorum－sensing mutants of Staphylococcus epidermidis in vivo［J］.J Infect Dis，2004，190(8):1498 －1505.