己酮可可堿對兔蛛網膜下腔出血后腦脊液中TGF-β1及蛛網膜纖維化作用的實驗研究

王 永，孫軍君，郭孝龍，段勇剛，常書峰，史保中

蛛網膜下腔出血(subarachniod hemorrhage, SAH)是神經科的一種常見急重癥，交通性腦積水是其常見的嚴重并發癥，致殘率高，目前研究認為其與蛛網膜的纖維化導致的腦脊液吸收障礙有關[1]。應用抗纖維化藥物減少SAH后蛛網膜纖維化，從而降低或預防慢性腦積水的發生，已作為一種治療手段在實驗與臨床應用中得到證實。己酮可可堿(pentoxifylline, PTX)是甲基黃嘌呤的衍生物，是一種非特異性磷酸二酯酶抑制劑，以往多用于心腦血管病的治療，近年來發現其還具有抗纖維化作用且日益受到重視，并在心、腎、肺、肝纖維化疾病及瘢痕組織的治療中得到應用，但其對蛛網膜纖維化的作用目前尚未見報道。本實驗通過枕大池兩次注血法建立蛛網膜下腔出血模型，應用己酮可可堿干預后檢測腦脊液中TGF-β1的濃度變化；21 d處死取腦，行Masson染色觀察蛛網膜膠原纖維含量，初步探討己酮可可堿對SAH后蛛網膜纖維化的影響及機制。

1 材料與方法

1.1動物及分組河南科技大學醫學院動物室提供清潔級健康新西蘭大白兔55只，雌雄不限，體質量2.0～2.5 kg。隨機分為空白組15只、模型組20只、己酮可可堿干預組20只。

1.2試劑及儀器戊巴比妥鈉(武漢博士德公司)；兔轉化生長因子β1(TGF-β1)定量檢測試劑盒(ELISA)[上海藍基(啟迪)生物技術有限公司]；PTX注射液(石家莊四藥有限公司，規格：5 mL，0.1 g，批號：20110203)；北航CMIAS4.0/4.1多媒體彩色病理圖文分析系統(河南科技大學醫學院病理教研室提供)。

1.3動物模型制作采用枕大池兩次注血法建立兔SHA模型。提前1 d將穿刺部位備皮，首先用戊巴比妥鈉30 mg/kg經耳緣靜脈將兔子麻醉，兔子取俯臥位固定于手術架上，備皮部位消毒鋪巾，用自制穿刺針(0.55×20號精密輸液器套于1 mL注射器內，注射器前端針頭留長約15 mm)在枕骨大孔上緣沿正中矢狀面于枕骨平面成45°夾角緩慢進針，待穿刺針有落空感，進針2～3 mm，緩慢抽出1 mL腦脊液后，快速取耳中動脈非抗凝血，按照1.0 mL/kg緩慢注入枕大池，注入時間1 min左右。注入完畢后，將兔置于頭低位約30 min。術后24 h重復同樣操作。空白組只抽取腦脊液，PTX干預組是在模型的基礎上從第2天開始給予PTX 8 mg/kg，每天鞘內注射治療，持續10 d。

1.4腦脊液測定分別在第3、7、11、16、21天時間點取腦脊液。將動物麻醉后緩慢抽取1.0 mL腦脊液(操作方法同前)，標本均立即存于-80℃冰箱保存待測。用ELISA法測定腦脊液中TGF-β1濃度，操作方法嚴格按照試劑盒上說明進行。

1.5動物標本制取及Masson染色模型組在制模成功后處死4只，觀察蛛網膜下腔出血，其余動物在第21天全部處死取腦。戊巴比妥鈉麻醉后，兔子仰臥固定于手術架上，開胸阻斷胸主動脈，18G套管穿刺針穿刺左心室，剪開右心房，37℃生理鹽水灌洗至流出無色液體后，4%多聚甲醛固定，小心咬除顱骨取出腦組織，放入Bouin固定液中固定72 h后，沖洗，取大腦凸面腦膜完整處脫水，透明，石蠟包埋，切片，Masson染色觀察。測蛛網膜厚度及平均灰度值，進定量分析，以100×厚度/灰度值作為衡量膠原纖維含量的指標。

2 結果

2.1腦脊液中TGF-β1的濃度變化模型組和干預組腦脊液中TGF-β1的濃度在第3天和第16天出現兩個高峰，但干預組較模型組顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，空白組無明顯改變，見表1。

表1 各組在各個時間點所測得腦脊中TGF-β1濃度值對比 pg/L

2.2蛛網膜Masson染色病理觀察結果切片染色顯示：①硬腦膜、蛛網腦膜明顯藍染，硬膜尤為明顯；②腦組織各層均無藍染；③模型組的蛛網腦膜明顯增厚，蛛網膜下腔發生黏連較多，Masson染色較深，④PTX干預組蛛網膜厚度介于模型組和空白組之間，蛛網膜下腔發生黏連較模型組少，Masson染色較模型組淺。經CMIAS 4.0/4.1多媒體彩色病理圖文分析系統測量蛛網膜的灰度值及厚度，模型組灰度值低于空白組(P<0.05)，厚度值大于空白組(P<0.05)，膠原纖維含量大于空白組(P<0.05)；PTX干預組灰度值高于模型組(P<0.05)，厚度值小于模型組(P<0.05)，膠原纖維含量小于模型組(P<0.05)，見表2。

表2 蛛網膜纖維膠原病理圖像分析結果

3 討論

慢性腦積水是蛛網膜下腔出血后的常見慢性并發癥之一，嚴重影響患者的生活質量，甚至導致患者死亡。其形成機制目前尚未完全明確。目前研究多認為與血液刺激、炎癥介質釋放導致的蛛網膜及蛛網膜下腔纖維化影響腦脊液吸收有關[2]。有研究表明蛛網膜下腔出血后，蛛網膜中HA、LN、PIIINP的含量明顯增多，表明蛛網膜下腔出血后蛛網膜存在纖維增生現象，這可能是蛛網膜下腔出血后慢性腦積水形成的病理學基礎[1]。Sajanti等發現蛛網膜下腔出血患者腦脊液中I型原膠原(PICP)和PIIINP明顯升高[3-4]。目前臨床上應用地塞米松降低蛛網膜纖維化的程度，從而減少腦積水的發生率。但該種方法效果有限，且副作用明顯。

PTX分子式是C13H20N4O3，化學名為3，7-二甲基黃嘌呤，是甲基黃嘌呤的衍生物，是一種非特異性磷酸二酯酶抑制劑，能阻斷cAMP轉變為AMP，以往多用于心腦血管病的治療，近年來發現其還具有抗纖維化作用，且日益受到重視，并在心、腎、肺、肝纖維化疾病及瘢痕組織的治療中得到應用。本實驗通過鞘內注射給藥，研究PTX對SAH后蛛網膜纖維化的作用，結果表明，PTX干預組蛛網膜纖維化程度明顯降低，腦脊液中TGF-β1濃度明顯降低，提示PTX能夠減輕SAH后蛛網膜纖維化，為臨床預防和治療SAH后腦積水的發生提供借鑒。

研究表明腦脊液中TGF-β1增高在SAH后蛛網膜纖維化過程中起重要作用。TGF-β1是一種纖維源性細胞因子，不存在于正常腦脊液中[5]。SAH時進入蛛網膜下腔的血小板、膠質細胞和炎癥反應都可釋放TGF-β1到腦脊液中。Motohashi等發現TGF-β1經一系列信號傳遞增加了細胞外基質蛋白質的積聚，導致蛛網膜黏連、增厚，使蛛網膜下腔、蛛網膜絨毛及其他表淺的血管間隙、神經根周圍間隙纖維增生，發生閉塞，引起腦脊液回流和吸收障礙。TGF-β1還能促使軟腦膜細胞增殖，具有刺激腦脊液增多的作用[6]。這與本實驗中模型組腦脊液中TGF-β1明顯升高，蛛網膜纖維增生程度明顯的結論相符。

PTX能顯著抑制TGF-β1誘導的蛛網膜細胞膠原mRNA上調，從而降低膠原纖維的合成，能逆轉TGF-β1的促使各種間質產生細胞(如成纖維細胞)增殖和分泌的作用，可以起抑制肝臟、腎臟、肺臟、皮膚等多種器官纖維化及硬化的作用。而蛛網膜細胞是特化的成纖維細胞[7]，因而能夠應用PTX來減少SAH后腦脊液中TGF-β1合成和釋放，從而減低蛛網膜纖維化。PTX的抗纖維化作用還可能通過抑制細胞增生、抑制細胞外基質合成與分泌、抑制炎癥反應、清除自由基等途徑發揮作用[8]。通過對PTX抗蛛網膜纖維化發生機制的研究，將有助于理解SAH后慢性腦積水的形成原因，為防治腦積水提供新的思路和手段。

參考文獻：

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[4] Sajanti J, Heikkinen E, Majamas K．Rapid induction of meningeal collagen synthesis in the cerebral cisternal and ventricular compartments after subarachnoid hemorrhage[J]．Acta Neurochir，2011,143(8):821-826.

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[6] Motohashi O，Suzuki M，Yanai N，et al．Thrombin and TGF-β promote human leptomeningeal cell proliferation in vitro[J]. Neurosci Lett, 1995,190: 105-108.

[7] 成令忠，鐘翠平，蔡文琴．現代組織學[M]．上海：上海科學技術出版社，2003:456．

[8] 葉婷，劉曉城．己酮可可堿在腎臟疾病中的抗纖維化作用[J]．國外醫學泌尿系統分冊，2004,24(5)：655-658．