應用TP-ELISA（一步法）檢測梅毒螺旋體抗體結果分析

周兆華 王慶豐 顧慶華

常熟市疾病預防控制中心，江蘇常熟 215500

梅毒螺旋體抗體酶聯吸附免疫試驗（TP-ELISA）是隨著近年梅毒螺旋體的基因工程抗原研制成功而建立的方法，具有高特異性、高靈敏度高、檢測費用低、適宜大批量檢測的特點。 2010年12月，我們應用TP-ELISA 一步法檢測試劑對娛樂場所2107 名服務人員進行梅毒抗體檢測，對陽性標本或灰區標本用TPPA 試劑進行確認， 現將結果報道如下。

1 對象與方法

1.1 對象

本市娛樂場所服務人員共2107 名，其中男性488 名，女性1619 名。

1.2 試劑

TP-ELISA 一步法試劑采用上海科華公司生產的，TPPA 試劑采用日本富士公司生產的，RPR 試劑采用上海科華公司生產的，所有試劑均在有效期內。

1.3 方法

應用TP-ELISA 試劑對2107 份標本檢測，對灰區標本按1:8，1：16，1:32，1:64，1:128，1:256 稀釋倍數檢測， 最后用TPPA 試劑對陽性和灰區標本進行確認，并做RPR 滴度試驗，灰區OD 值范圍設定為0.06～0.20。

1.4 儀器

RPR 旋轉儀為新康XK96-6 梅毒旋轉振蕩器，酶標儀為SUNRISE，洗板機為TECAN。

2 結果

2.1 TP-ELISA、TPPA 和RPR 檢測情況

TP-ELISA 法檢出陽性標本96 份，經TPPA 確認均為陽性，灰區標本16 份，經TPPA 確認9 份 陽性，7 份陰性。 105 份TPPA 陽性標本中，RPR 陽性43 份，其中原滴陽性12 份，1:2陽 性13 份，1:4 陽 性2 份，1:8 陽 性5 份，1:16 陽 性6 份，1:32陽性5 份。

2.2 灰區標本不同稀釋倍數檢測情況

TPPA 陽性的9 份灰區標本經1:8，1:16，1:32，1:64，1:128，1:256 稀釋檢測，結果顯示OD 值在1:16 和1:32 時為最高，反應呈強陽性，RPR 滴度為1:8～1:32，見表1。

表1 9 份灰區標本不同稀釋倍數檢測OD 值及RPR 滴度

2.3 灰區標本兩步法檢測OD 值

將一步法試劑分成兩步進行，即加血清溫育30 min，洗板后加酶標抗原，溫育30 min 后顯色，結果9 份灰區標本OD 值均明顯升高，見表1。

3 討論

TP-ELISA 是近年來隨著梅毒螺旋體基因工程抗原研究成功而建立的方法，操作簡單、反應快速、敏感性高、結果易于判斷等優點被廣泛采用。 但是當標本中梅毒螺旋體抗體濃度很高時會產生鉤狀效應，標本OD 值會很低或處于灰區，易造成漏檢。 鉤狀效應指待測標本中抗原或抗體濃度的增加而升高至一定程度后，測定吸光度隨抗原或抗體濃度的增加而開始下降直至不顯色，而出現假陰性結果的問題[1]。本次調查顯示9 份標本OD 值處于灰區內，TPPA 陽性，RPR 滴度為1:8～1:32，分析其原因應該是高濃度的抗體引起了鉤狀效應，使標本的OD 值偏低。其中兩份OD 值較低，分別是0.065和0.097，按照TP-ELISA 試劑說明書，標本OD 值>0.105 判定為陽性，則這兩份標本會漏檢，有關報道也指出ELISA 法檢測梅毒抗體的吸光度值在0.10～0.15 之間的標本容易出現假陰性[2]。

解決鉤狀效應的最好辦法就是采用兩步法試劑，酶標抗原和抗體分兩步加入，不存在競爭抑制作用，可以避免鉤狀效應的產生[3]，本次調查顯示9 份灰區標本用兩步法檢測，OD 值均明顯升高，避免了灰區問題。 同時本次調查顯示一步法試劑檢測稀釋后的灰區標本，在1∶16 或1∶32 時獲得最強反應，說明存在鉤狀效應的標本可通過稀釋后檢測消除，這與有關報道相一致[1，4]。 另外，實際工作中我們發現，有一些TPPA 陽性標本，一步法檢測OD 值稍高于灰區，大約0.2～0.4 之間，二步法檢測反而呈陰性，這可能是二步法降低了實驗的靈敏度。 因此TP-ELISA 一步法試劑初篩梅毒螺旋體抗體，對于灰區標本，可以用稀釋法或二步法復測消除鉤狀效應，做TPPA 試驗確認，同時可作RPR 滴度試驗，能夠避免因鉤狀效應造成的陽性標本漏檢，但是那些因鉤狀效應引起的OD 值處于設定的灰區以下的標本，還是有漏檢可能性。 如果初次檢測時，同步做血清原倍和1∶16 稀釋檢測，可以避免OD 值在灰區或以下的陽性標本漏檢，但相應地增加了工作量，如果初檢直接用二步法，也可避免灰區陽性標本漏檢，但可能會漏檢部分弱陽性標本，因此這是個有待解決的問題。

[1] 李金明.血液感染性疾病標志物篩檢中應重視的若干問題[J].中華檢驗醫學雜,2005,28(6):569-571.

[2] 李韶深,劉春莉,劉琳,等.梅毒ELISA 和TPPA 兩種試驗方法的血清質量控制的體會[J].中國皮膚性病學雜志,2005,19(3):183.

[3] 尹琦,徐玉.TP-ELISA 一步法在檢測梅毒螺旋體抗體中的鉤狀效應分析[J].右江醫學,2009,37(4)：421-423.

[4] 王海濱,林霞.ELISA 一步法與TPPA 法檢測梅毒螺旋體抗體應用分析[J].重慶醫學,2009,38(12):1438-1440.