不同劑量α-硫辛酸對卡那霉素所致豚鼠耳聾后聽覺誘發電位的影響

米彥芳 董明敏

1）鄭州大學第二附屬醫院耳鼻喉科 鄭州 450014 2）鄭州大學第一附屬醫院耳科 鄭州 450052

α-硫辛酸（alpha-lipoic acid，LA）是一種抗氧化劑，可通過清除自由基、螯合金屬離子、再生其他抗氧化劑等途徑發揮抗氧化作用。其優勢在于可以在水、脂兩相狀態發揮其抗氧化作用；以及可以通過血-迷路屏障及血-腦屏障［1］。有研究表明，它可以阻止卡那霉素的激活；抑制活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的形成；清除多余的ROS；增加體內其他抗氧化物質（如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、丙二醛）的含量及其活性等方式，發揮其保護耳蝸內、外毛細胞等組織細胞的作用。

1 實驗材料與方法

1.1 動物及分組 70只白色、紅目豚鼠（選用耳廓反射靈敏；健康；無中耳疾病），雌雄不分，體質量120～150g，由河南省實驗動物中心提供。聽性腦干反應（ABR）檢查閾值正常。在實驗期間，自由飲食。按照隨機抽樣的原則，將試驗動物分成7組（每組10只，20耳）：Ⅰ組：正常對照組：不施加任何處理因素；Ⅱ組：KM 組：KM 400 mg／（kg·d）。Ⅲ組：LA 組：LA 50 mg／（kg·d）。Ⅳ組：治 療 組1（25 mgLA）：KM 400mg／（kg·d）＋LA 25 mg／（kg·d）。Ⅴ組：治療組2（37.5 mgLA）：KM 400 mg／（kg·d）＋LA 37.5mg／（kg·d）。Ⅵ組：治療組3（50 mgLA）：KM 400 mg／（kg·d）＋LA 50 mg／（kg·d）。Ⅶ組：治療組4（75 mgLA）：KM 400mg／（kg·d）＋LA 75mg／（kg·d）。

1.2 儀器及試劑

1.2.1 主要儀器：Cadwell Quantum 84型誘發電位系統（美國產），及其配套的Microline-184型打印機。

1.2.2 主要試劑：KM：購自安徽省皖北藥業股份有限公司；LA：上海浦東制藥廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 用藥方法：Ⅱ組、Ⅳ～Ⅶ組豚鼠，KM 肌內注射400 mg／（kg·d），連用7d。Ⅲ～Ⅶ組豚鼠的LA 腹腔注射。同時用KM 及LA 時，兩藥相隔時間12h。

1.3.2 觀察指標及方法：觀察豚鼠的一般行為，記錄；停藥后測ABR。

1.3.3 ABR 測試：麻醉：選用10%水合氯醛（150 mg／kg），腹腔內注射。麻醉達成后，置實驗豚鼠于隔離的電屏蔽室內。隔離室內，本底噪聲選用30dB HL。測試期內，豚鼠肛溫保持在38℃左右。

1.4 統計學分析 本實驗的數據采用SPSS 13.0 統計軟件，進行統計學分析，采用t檢驗、單因素方差分析，以α＝0.05作為檢驗的標準。

2 結果

2.1 日常狀態 Ⅱ組（KM）和Ⅳ組（25mg LA）的豚鼠在給藥后2d，即可出現以下反應：活動量下降；飲食量減少。繼續給KM 及LA，上述反應日漸明顯，并出現耳廓下垂、毛蓬松并失去光澤等現象。其余各組豚鼠無明顯異常的表現。

2.2 ABR 結果 見表1、2。各波的潛伏期、Ⅰ～Ⅲ波間期及閾值：Ⅰ組（正常對照組）、Ⅴ組（37.5 mg／（kg·d）LA 治療組）～Ⅶ（75mg／（kg·d）LA）組之間的各波的潛伏期、Ⅰ～Ⅲ波間期及閾值的差異，無統計學意義。Ⅲ組（LA 組）和Ⅳ組（25mg／（kg·d）LA）的各波的潛伏期、和Ⅰ～Ⅲ波間期稍延長，閾值稍高。雖然Ⅲ組和Ⅳ組之間的差異沒有統計學意義。但是，與其他組豚鼠ABR 的差異顯示出統計學意義。Ⅱ組（KM 組）豚鼠的ABR 各波潛伏期、及Ⅰ～Ⅲ波間期最長，閾值也最高，與其他各組豚鼠ABR 的差異有統計學意義。

表1 ABR 結果 （ms）

表2 ABR 閾值結果 （dB）

3 討論

3.1 卡那霉素耳毒性機制 實驗可見，KM 組的豚鼠ABR各波的潛伏期以及Ⅰ～Ⅲ波的間期都明顯延長，并伴隨閾值上升。由此可見：400mg／（kg·d）卡那霉素，連用一周，即可損傷到豚鼠耳蝸的組織細胞，發揮其耳毒性作用。

雖然，學術上關于氨基糖甙抗生素的耳毒性機制有許多觀點；但是，伴隨著可直接檢測到使用氨基糖甙類抗生素以后，耳蝸組織內可產生出大量的ROS，氨基糖甙類抗生素可以在耳蝸的組織細胞內誘發ROS的合成已成為定論。隨著大量的實驗證據表明：在卡那霉素的耳毒性機制中，ROS增多發揮著重要作用。1999年Sha［2］等證實卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素、新霉素等氨基糖甙類抗生素均可刺激耳蝸組織細胞產生ROS，同時提出可能的機制：（1）鐵與氨基糖甙類抗生素形成非活性的復合體：Fe3＋-AmAn；（2）Fe3＋-AmAn還原成Fe2＋-AmAn，后者具有氧化活性；（3）催化O2與一電子形成.O2-；（4）經過鏈式反應形成：如H2O2等自由基。在耳蝸組織細胞中，每一步還原過程都可以產生“副產品”--ROS。該研究還進一步地證實了ROS與氨基糖甙類抗生素的耳毒性之間的關系，并提出ROS清除劑可拮抗氨基糖甙類抗生素的耳毒性。

3.2 LA 的抗氧化性 以及抗氨基糖甙類抗生素耳毒性的機制α-硫辛酸，美國生物化學醫學會稱其為lipoic acid（LA）［3］，因此，本文以LA 稱之。作為高效的、能量型氧自由基清除劑，LA 的分子量很小（＜150），還是存在于人體內的、天然型代謝物質。因此，外源性的LA 很容易被機體的組織細胞吸收和利用。另外，LA 在機體組織內容易轉化，可被還原為二氫硫辛酸（dihydrolipoic acid，DHLA）。所以，LA 在機體組織內是以LA 和DHLA 兩種形式存在的，二者在體內互相協調、互相補充，有效地清除大部分的氧自由基。LA 可以螯合金屬離子，抑制ROS的產生，及防止脂質過氧化的損傷。LA 和DHLA 二者都為雙歧性因子，其溶解性無論在脂相還是水相中均表現良好，其抗氧化作用可以充分發揮。LA 可通過血-腦屏障和血-迷路屏障，可以在內耳迷路中發揮其抗氧化作用。LA 還可再生其他的抗氧化劑：如激活VitC、VitE、GSH 等，進一步對機體的抗氧化防御系統進行修復；對有關組織細胞正常生長和代謝起影響作用的調節蛋白進行保護；對HIV 的復制過程進行抑制；抑制性影響轉錄因子NF-κB的激活過程。故而作為“通用型抗氧化劑”得到共識［4-5］。大量資料對于LA 的抗氧化效果進行了肯定。

本研究顯示：Ⅴ組～Ⅶ組的豚鼠，一般情況和ABR 結果等觀察項目，與Ⅰ組相比較，差異無統計學意義。與Ⅱ組相比，Ⅳ組中豚鼠的各項觀察指標提示明顯改善。由此分析：LA 對卡那霉素致耳毒性作用起拮抗效應，可以對豚鼠的耳蝸組織細胞起保護作用。與Conlon［6］等采用LA 對氨基糖甙類抗生素耳毒性進行拮抗研究的觀察結果。

氨基糖甙類抗生素在進入機體后，特別是在內淋巴內由Fe進行激活，可增加耳蝸組織細胞內的ROS，從而對耳蝸的抗氧化防御系統進行破壞，造成LPO 損害。由此提示LA 對卡那霉素致耳毒性的拮抗機理有可能是：（1）LA 螯和金屬Fe，防止激活卡那霉素，抑制生成ROS。（2）增加抗氧化劑（包括SOD、GSH、維生素等）的活性和含量，保護耳蝸組織的抗氧化防御系統，同時，清除多余的ROS，抑制LPO、對耳蝸組織起保護作用。（3）對于調節蛋白（起維持組織細胞生長及代謝作用）起保護作用。最值得關注的是：LA 可進入迷路組織，發揮抗氧化作用。因此，LA 可以用于防治氨基糖甙類抗生素的耳毒性。本實驗，在進一步證實ROS在卡那霉素耳毒性機制中，發揮重要作用的同時高度評價了LA 抗氨基糖甙類抗生素耳毒性的臨床治療價值。

在本研究中對Ⅲ組豚鼠的各項指標觀察結果顯示：即使單純應用大劑量LA，也可以產生耳毒性效應。此項結果與Conlon［6］的觀察并不一致。檢索既往的文獻報告，相關的實驗及臨床研究中未見類似報道。亦有其他研究報道，在生理條件下，外源性LA 可以對機體內的氧化反應起抑制作用，從而起到超抗氧化效應［7］。可是，對正常機體組織而言，超抗氧化作用究竟是利是弊，與相關的生物體系有關，對此仍需進一步審重評估。在既往的實驗中，該藥一貫表現出較好的耐受性，在針對人體的臨床研究中，亦未見顯著不良反應和毒性表現。故而，LA 的耳毒性可能與超抗氧化作用有關，也可能是制劑純度不夠，甚或有其他原因存在，目前尚無清晰認識。本研究尚不可以由此推論，LA 的大劑量應用會導致豚鼠的聽力出現下降，仍需要深入的實驗研究。

［1］Packer L.Alpha-lipoic acid：A metabolic antioxidant which regulates NF-kappa B signal transduction and protects against oxidative injury［J］.Drug Metab Rev，1998，30：245-275.

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［3］Biewenga G，Haenen GR，Bast A.The role of lipoic acid in the treatment of diabetic poly-neurophathy［J］.Drug Metab Rev，1997，29（4）：1 025-1 054.

［4］Packer L.Alpha-lipoic acid：A metabolic antioxidant which regulates NF-kappa B signal transduction and protects against oxidative injury［J］.Drug Metab Rev，1998，30：245-275.

［5］Roy S，Packer L.Redox regulation of cell functions by alpha-lipoicoate：Biochemical and molocular aspects［J］.Biofactor，1998，8：17-21.

［6］Conlon BJ，Aran JM，Erre JP，et al.Attenuation of aminoglycoside-induced cochlear damage with the metabolic antioxidant α-lipoic acid［J］.Hear Res，1999，128：40-44.

［7］Biewenga GP，Haenen GR，Bast A.The pharmacology of the antiocidant lipoic acid［J］.Gen Pharmac，1997，29：315-331.