Th1細胞在NOD小鼠糖尿病早期的應用

王弘珺 李質馨 楊 柳 田洪艷 徐 冶 朱辛為 劉忠平

(吉林醫藥學院組織胚胎學教研室，吉林 吉林 132013)

60%～80%的雌性NOD小鼠出生后12 w會自發出現糖尿病癥狀，屬于1型糖尿病，是由T細胞介導的自身免疫性疾病。研究表明，Th1細胞分化發育異常在1型糖尿病的發生中起重要作用〔1〕。本文選擇4 w、8 w和16 w雌性NOD小鼠，測定不同年齡NOD小鼠血糖的變化及脾和胰腺內Th1細胞的變化，探討Th1細胞在NOD小鼠糖尿病早期中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 4 w、8 w和16 w清潔級(SPF)NOD雌性小鼠，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，每組6只。熒光標記的抗小鼠CD4、CD25和干擾素-γ(IFN-γ)單抗及同型對照抗體BD，抗小鼠免疫球蛋白受體(FcR)單抗(自制)，抗T-bet抗體(武漢博士德)，鏈霉素生物蛋白過氧化物酶法(S-P)試劑盒(福州邁新生物)，離子霉素(Ionomycin，lon)和佛波醇酯(PMA)(Sigma)。Golgi Stop BD，流式細胞儀和血糖儀(美國強生)。

1.2 方法

1.2.1 血糖檢測 無菌取小鼠尾靜脈血用血糖儀檢測血糖。

1.2.2 脾細胞的制備 乙醚麻醉，取小鼠脾，用毛玻璃片擠壓，過200目尼龍網制成單細胞懸液，用紅細胞裂解液去除紅細胞，懸浮于PBS中，計數。

1.2.3 脾Th1細胞的測定 取2×106細胞用PMA和Ionomycin活化4～6 h，同時加入Golgi Stop，CD4+T細胞內IFN-γ的染色過程按照BD說明書進行，上機檢測。

1.2.4 胰腺免疫組化 取胰腺，10%中性甲醛緩沖液4℃固定24 h，然后各級酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋。常規石蠟切片，梯度酒精脫水，抗原修復;雙蒸水洗入3%H2O210 min，PBS洗滌;山羊血清室溫封閉10 min;加1∶100稀釋抗T-bet抗體，4℃過夜，PBS洗滌;生物素標記的山羊抗小鼠IgG抗體室溫10 min，PBS洗滌;SD室溫10 min，PBS洗滌;DAB顯色2 min，脫水透明封片。陰性對照用PBS代替一抗。

1.3 統計學方法 應用SPSS11.5統計軟件進行分析，結果用s表示，數據分析采用t檢驗。

2 結果

2.1 血糖的變化 實驗所用雌性NOD小鼠，4 w時血糖為(5.08±0.22)mmol/L，8 w 時血糖為(6.48±0.53)mmol/L，16 w時血糖為(11.59±0.92)mmol/L，血糖呈進行性增高，16 w與8、4 w之間差異顯著(P＜0.01，P＜0.001)。

2.2 CD脾Th1細胞的變化 Th1細胞屬于CD4+T細胞亞群，主要分泌細胞因子IFN-γ，CD4+IFN-γ+T細胞即為 Th1細胞。4、8、16 w NOD小鼠脾Th1細胞的百分數分別為(2.46±0.10)%、(2.84±0.30)%及(5.07±0.91)%，16 w NOD小鼠脾Th1細胞的百分數高于4 w和8 w NOD小鼠(P＜0.05;P＜0.01)。

2.3 胰腺內Th1細胞的變化 4 w NOD小鼠胰腺內未見Th1細胞浸潤，從8 w開始NOD小鼠胰腺內Th1細胞浸潤逐漸增加。見圖1。

圖1 胰腺Th1細胞免疫組化(×200)

3 討論

NOD小鼠出生4 w開始胰島周圍逐漸出現淋巴細胞浸潤，12 w時60%～80%雌性小鼠出現糖尿病癥狀，并進行性加重，其糖尿病病理變化和臨床表現均類似人類1型糖尿病，是目前研究1型糖尿病的主要動物模型。細胞免疫異常是引起NOD小鼠發生糖尿病的原因之一，尤其是CD4+T細胞亞群分化失衡在糖尿病進程中起重要作用〔1，2〕。CD4+T細胞亞群主要有Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞和CD4+CD25+Treg細胞，其中Th1釋放 IFN-γ、腫瘤壞死因子 α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β)引起炎癥反應，與糖尿病時胰島β細胞凋亡有關〔3〕，直接參與了糖尿病的發生過程。目前，對于NOD小鼠糖尿病初期外周和胰腺內Th1細胞的變化并不完全清楚。本文研究了4 w、8 w和16 w雌性NOD小鼠血糖的變化及脾和胰腺內Th1細胞的變化。本研究中，隨年齡增加雌性NOD小鼠血糖逐漸升高，至16 w時已經出現高血糖，并出現其他糖尿病癥狀如尿糖陽性等。為了研究Th1細胞的變化，通過流式細胞儀檢測了脾Th1細胞，通過免疫組化檢測了胰腺內Th1細胞。流式細胞儀結果顯示4 w、8 w和16 w NOD小鼠脾Th1細胞逐漸升高，16 w時NOD小鼠脾Th1細胞顯著高于4 w時。說明，NOD小鼠糖尿病早期外周Th1細胞亞群異常增加，其原因可能與CD4+CD25+Treg細胞不足有關。有研究表明，1型糖尿病中CD4+CD25+Treg細胞有缺陷，不能維持自身免疫耐受〔4～8〕，這可能引起Th1細胞增加，導致NOD小鼠發生糖尿病。

T-bet是誘導Th1細胞分化的關鍵轉錄因子，4 w NOD小鼠胰腺內并未檢測到T-bet陽性細胞，說明這時Th1細胞沒有明顯浸潤到胰腺。在8 w和16 w NOD小鼠胰腺內檢測到大量的T-bet陽性細胞，說明Th1細胞大量浸潤胰腺，參與胰腺β細胞凋亡，于是出現高血糖等糖尿病癥狀。

1型糖尿病患者主要為青少年，糖尿病表現是由于胰島β細胞破壞所引起。免疫因素在1型糖尿病發生中起重要作用，尤其是Th1細胞及其釋放的細胞因子在糖尿病發生早期起關鍵作用。在1型糖尿病發生早期，通過中西藥治療降低Th1細胞，減輕胰島β細胞凋亡，能夠延緩糖尿病癥狀的出現。

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