多器官功能障礙綜合征小鼠巨噬細(xì)胞移動抑制因子釋放對單核細(xì)胞免疫相關(guān)指標(biāo)的影響

涂 玲 梁穎紅 劉 佳 張俊華 魏 明 杜 英 (鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450052)

本研究旨在觀察多器官功能障礙綜合征(MODS)小鼠在病程不同階段血清巨噬細(xì)胞移動抑制因子(MIF)含量的變化、反映免疫狀況的外周血單核細(xì)胞MHC-Ⅱ類分子(IAb)表達(dá)規(guī)律及T淋巴細(xì)胞亞群的變化，分析MIF釋放量的變化與單個(gè)核細(xì)胞免疫功能相關(guān)指標(biāo)異常的關(guān)系，初步認(rèn)識MODS發(fā)生、發(fā)展中MIF釋放的規(guī)律及其對細(xì)胞免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 動物分組及動物模型 6～8周齡雄性C57BL/6小鼠100只，體重20～25 g，鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，飼以標(biāo)準(zhǔn)食物。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，自由飲水。動物隨機(jī)分為正常組，酵母多糖致傷后 3、8、12 h 和傷后 1、2、3、5、12 d共9組。采用腹腔注射無菌酵母多糖的方法制作MODS模型〔1〕。實(shí)驗(yàn)組動物腹部皮膚常規(guī)消毒后，無菌注射酵母多糖懸液(2.5 g/100 ml石蠟油，注射劑量1 g/kg體重)。

1.2 血清MIF含量 分別取各時(shí)間點(diǎn)動物血清24 μl加6 μl 5×凝膠加樣緩沖液，混勻后100℃水浴5 min，離心后上樣，12%分離膠電泳;轉(zhuǎn)膜，免疫印跡:一抗為抗小鼠MIF多抗，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(北京中杉金橋公司)，稀釋度分別為1∶3 000和1∶2 000。用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(Pierce公司)。

1.3 外周血單核細(xì)胞MHC-Ⅱ類分子(IAb)表達(dá) 取小鼠眼球血 100 μl，加入 FITC 標(biāo)記 IAb 抗體5 μl，經(jīng)裂解紅細(xì)胞、避光孵育、固定后，用射門法在流式細(xì)胞儀(BD公司)上測定IAb陽性細(xì)胞數(shù)并計(jì)算其百分比。

1.4 外周血T淋巴細(xì)胞亞群的分析 從小鼠眼球取血100 μl，肝素抗凝;加入 FITC-CD4 抗體和 PE-CD8 抗體各 5 μl，混勻后避光孵育30 min;加入紅細(xì)胞裂解液后再避光孵育8 min;室溫離心(1 500 r/min，5 min);細(xì)胞沉淀加入0.1 ml 4%多聚甲醛和0.4 ml PBS吹打混勻;用射門法在流式細(xì)胞儀上檢測FITC-CD4抗體和PE-CD8抗體標(biāo)記的淋巴細(xì)胞并分別計(jì)數(shù)，計(jì)算CD4+/CD8+細(xì)胞比值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Stata7.0軟件分析，數(shù)據(jù)以s表示，均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 血清MIF含量的變化 正常組及酵母多糖致傷后3、8 h組血清未檢測到MIF蛋白表達(dá)條帶，12 h組血清可見MIF表達(dá)帶，表達(dá)量為(0.63±0.19)ng/ml，1 d組表達(dá)量最多，為(1.43±0.28)ng/ml，隨后逐漸降低，5 d組未測到，但10 d組又增至較高水平，為(0.89±0.24)ng/ml。

2.2 外周血單核細(xì)胞IAb表達(dá)的規(guī)律 正常組外周血單個(gè)核細(xì)胞IAb表達(dá)量在30%以上;注射酵母多糖后8 h，外周血單個(gè)核細(xì)胞IAb表達(dá)量明顯下降(P＜0.05);傷后2 d，IAb表達(dá)更少(P＜0.01)，傷后5 d IAb表達(dá)量有所恢復(fù)，但仍未達(dá)到正常組水平;傷后10 d，IAb表達(dá)再次下降，不足正常組的1/3(P＜0.01)，與5 d組比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 外周血單個(gè)核細(xì)胞IAb表達(dá)和T淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+比值的變化(n=10，s)

表1 外周血單個(gè)核細(xì)胞IAb表達(dá)和T淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+比值的變化(n=10，s)

與正常組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與5 d組比較:3)P＜0.05

組別 IAb陽性率 CD4+/CD8+32.46±6.57 3.32±0.78 MODS組 8 h 18.56±4.821) 1.33±0.241)2 d 13.54±3.652) 1.07±0.212)5 d 24.78±6.14 1.82±0.431)10 d 9.87±2.782)3) 0.70±0.172)3)正常組

2.3 外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化 注射酵母多糖8 h組，CD4+細(xì)胞比例減少，而CD8+細(xì)胞比例增加，兩者比值降低(P＜0.05);傷后2 d組，CD4+細(xì)胞比例降至最低，同時(shí)CD8+細(xì)胞比例也減少，兩者比值仍在低水平(P＜0.01);傷后5 d，CD4+細(xì)胞比例增加，CD4+/CD8+細(xì)胞比值雖有增加，但仍低于正常組;傷后10 d，CD4+細(xì)胞比例再度減少，而CD8+細(xì)胞比例明顯增加，CD4+/CD8+比值小于1。

2.4 血清MIF含量與CD4+/CD8+比值及外周血單核細(xì)胞IAb表達(dá)水平的關(guān)系 在病程早期的傷后12 h，血清MIF急劇升高，而此時(shí)CD4+/CD8+比值下降;傷后5 d進(jìn)入緩解期，血清MIF水平降至接近正常，CD4+/CD8+比值也有所恢復(fù);當(dāng)進(jìn)入第2次打擊的傷后10～12 d時(shí)，血清MIF水平再度升高，并伴隨CD4+/CD8+比值再次下降。

3 討論

MIF不僅可抑制巨噬細(xì)胞的自由移動，參與遲發(fā)性超敏反應(yīng)，還具有多種其他生物學(xué)作用。作為一種作用廣泛的前炎癥因子，MIF可參與宿主對微生物感染時(shí)發(fā)生的系列應(yīng)激反應(yīng)，能活化巨噬細(xì)胞，抑制其游走移動，增強(qiáng)其黏附、吞噬作用及殺滅腫瘤的活性。它是部分炎癥性疾病中的關(guān)鍵介質(zhì)，尤其在介導(dǎo)內(nèi)毒素和膿毒癥休克中起著關(guān)鍵作用。

本研究采用腹腔注射過量酵母多糖引起免疫反應(yīng)過高和炎癥反應(yīng)遷延失控，進(jìn)而誘發(fā)膿毒癥，導(dǎo)致MODS〔1〕，其發(fā)展過程較好地模擬了臨床MODS的所謂“雙相打擊”病程。研究結(jié)果顯示，正常組動物血清未檢測到MIF的存在;動物致傷后12 h，血清中MIF水平開始上升，傷后1～2 d達(dá)到高峰，隨后下降，傷后10 d再次顯著升高。這一規(guī)律與動物全身性炎癥反應(yīng)的程度及預(yù)后密切相關(guān);血清MIF第一個(gè)高峰，動物處于過度炎癥反應(yīng)階段，血清MIF來源于組織和外周血單核巨噬細(xì)胞分泌〔2〕，以及組織細(xì)胞損傷釋放〔3〕;血清 MIF第二次升高時(shí)，動物正值MODS期，此時(shí)機(jī)體免疫機(jī)能低下，大量的組織細(xì)胞壞死，因此血清MIF的升高可能源自壞死細(xì)胞的釋放〔4〕。血中大量的MIF將對血中和各組織器官中的免疫細(xì)胞和實(shí)質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生廣泛的影響〔5～9〕。

抗原提呈細(xì)胞表面MHC-Ⅱ類分子表達(dá)量的多少直接反映了其提呈抗原的能力，從而決定了T細(xì)胞的活化水平和免疫應(yīng)答能力〔10〕。本研究提示MIF對MODS小鼠預(yù)后的影響與其抑制抗原提呈細(xì)胞MHC-Ⅱ類分子表達(dá)、抑制細(xì)胞免疫應(yīng)答能力，導(dǎo)致免疫失衡有關(guān)。本研究結(jié)果表明，在MODS病程的早期采用抗MIF治療，可以通過改善抗原提呈細(xì)胞的功能和T輔助細(xì)胞亞群的比例，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡，阻止免疫失衡的發(fā)生，進(jìn)而阻止MODS的發(fā)生和發(fā)展。

有研究認(rèn)為，MIF是通過抑制皮質(zhì)類固醇激素對胞液IκB表達(dá)的上調(diào)對抗皮質(zhì)類固醇等炎癥因子的分泌，從而抵抗皮質(zhì)類固醇激素在 NF-κB/IκB 信號轉(zhuǎn)換通路中的效應(yīng)〔6〕。NF-κB是普遍存在于免疫細(xì)胞胞液中的轉(zhuǎn)錄因子，可被炎癥刺激(細(xì)胞因子、LPS、病毒)活化。當(dāng)炎癥刺激與其受體結(jié)合，即可激活細(xì)胞內(nèi)一系列磷酸化反應(yīng)，導(dǎo)致IκB分裂崩解，而IκB是一種阻礙蛋白，能阻礙NF-κB的釋放。一旦 IκB崩解，NF-κB即釋放活化，轉(zhuǎn)移至胞核中激活炎癥因子的轉(zhuǎn)錄。皮質(zhì)類固醇激素通過與胞液中的受體結(jié)合為復(fù)合物，轉(zhuǎn)移到核中，促進(jìn)IκB的轉(zhuǎn)錄，從而抑制炎癥介質(zhì)的釋放。而大量的IκB可限制NF-κB于胞液中，阻止炎癥介質(zhì)基因的表達(dá)。研究者在實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用LPS刺激人外周血單核細(xì)胞可引起胞液中IκB水平下降及核中NF-κB DNA結(jié)合力上升。在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入生理劑量的潑尼松(50～200 ng/ml)可降低LPS的該種效應(yīng)。即潑尼松可上調(diào)IκB的表達(dá)，抑制NF-κB。而當(dāng)再加入1 ng/ml的MIF時(shí)則可抑制潑尼松的效應(yīng)，使得胞液中IκB水平下降及核中NF-κB DNA結(jié)合力上升。在無LPS的情況下，MIF也同樣可抑制潑尼松誘導(dǎo)的IκB的升高。說明了MIF抵消皮質(zhì)類固醇激素的作用可能是阻止了潑尼松引起的IκB合成的增多，從而阻斷了其對炎癥因子表達(dá)的限制。

MIF是炎癥免疫反應(yīng)中的重要細(xì)胞因子，雖然近來已有一些研究證實(shí)了MIF在炎癥反應(yīng)中某些方面的作用機(jī)制〔11〕，還需要更多的研究去發(fā)現(xiàn)其完整的作用機(jī)制。一旦明確了MIF的作用機(jī)制，可有助于合理調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)，在機(jī)體需要免疫反應(yīng)時(shí)增強(qiáng)MIF的作用以殺滅病原菌，反應(yīng)過度時(shí)則抑制其作用以防出現(xiàn)全身性炎癥反應(yīng)綜合征，以抵抗疾病，維持機(jī)體健康，同時(shí)還可實(shí)現(xiàn)對皮質(zhì)類固醇激素更合理的使用。

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