阿爾茨海默病模型小鼠凋亡相關蛋白的表達

王曉映 劉 鵬 朱 華 徐艷峰 馬春梅 代小偉 劉 穎 秦 川

(中國醫學科學院實驗動物研究所 北京協和醫學院比較醫學中心，北京 100021)

阿爾茨海默病(AD)是一種神經系統退行性疾病，是導致老年人癡呆的主要原因，其特征性的病理改變是在大腦皮質和海馬區域出現老年斑和神經原纖維纏結。目前，AD的發病機制仍然不明確，一些研究發現，凋亡的異?？赡茉贏D的發生發展過程中起到重要作用。本實驗以APPswe/PSΔE9模型小鼠作為研究對象，探討AD中凋亡相關蛋白的表達情況。

1 材料與方法

1.1 APPswe/PSΔE9轉基因小鼠的建立 APPswe/PSΔE9轉基因小鼠由中國醫學科學院實驗動物研究所構建并提供〔1〕。APPswe轉基因編碼一段人鼠嵌合的蛋白，其中APP的胞外和胞內區域為鼠源性序列，而Aβ結構域為人源性序列并包含瑞士突變K594N/M595L。PSΔE9轉基因編碼人源性E9外顯子缺失的PS1。轉基因小鼠在出生9～14 d用剪趾法標記，收集剪下的組織及鼠尾，用堿裂解法提取基因組DNA，PCR分別檢測APPswe及 PSΔE9基因的表達。APP基因 PCR產物長344 kb，PS基因PCR產物長608 kb。

1.2 Western印跡法檢測bcl-2、caspase-9以及活化caspase-3的表達 將小鼠脫頸處死后，迅速取出其腦組織，用生理鹽水洗去血液，立即置于RIPA蛋白裂解液中，提取總蛋白。蛋白濃度用BCA法進行測定。蛋白上樣量為40 μg，利用12%的SDSPAGE膠進行分離，然后將其轉移至NC膜(Millipore)上，室溫下封閉 1 h，與 bcl-2(Abcam)、capase-9(Millipore)及 caspase-3(Abcam)抗體進行雜交，4℃過夜，用TBST洗膜3次，與辣根酶標記的羊抗兔IgG和GAPDH進行雜交，室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，然后進行化學發光。

1.3 統計學分析 運用SPSS11.0統計軟件。用t檢驗對Western印跡的結果進行統計學分析。

2 結果

2.1 APPswe/PSΔE9轉基因小鼠鼠尾DNA鑒定結果 裂解鼠尾后提取DNA，分別用針對APP，PS1的引物進行擴增，篩選鑒定陽性小鼠，部分檢測結果見圖1。

圖1 APPswe/PSΔE9轉基因小鼠鼠尾DNA PCR鑒定結果

2.2 APPswe/PSΔE9轉基因小鼠和對照小鼠腦組織中bcl-2蛋白的表達情況 利用Western印跡的方法分別檢測了3月齡和6月齡小鼠腦組織中bcl-2蛋白的表達情況，并將檢測結果進行半定量分析。由圖2可以看出，與同月齡的野生型對照小鼠相比，APPswe/PSΔE9轉基因小鼠中，bcl-2表達水平明顯降低。每個月齡均用了12只小鼠，其中6只為模型鼠，6只為同月齡的野生型對照鼠。為了保證實驗結果的準確性和可重復性，所有實驗均重復3次。見表1。

圖2 APPswe/PSΔE9轉基因小鼠和對照小鼠腦組織中bcl-2蛋白表達情況

2.3 APPswe/PSΔE9轉基因小鼠和對照小鼠腦組織中caspase-3和caspase-9的表達情況 與對照相比，3月齡和6月齡APPswe/PSΔE9小鼠中活化的caspase-9和caspase-3蛋白水平均升高(圖3)。見表1。

表1 各組小鼠腦組織bcl-2、caspase-3、caspase-9的表達(n=12，s)

表1 各組小鼠腦組織bcl-2、caspase-3、caspase-9的表達(n=12，s)

月齡對照組 37.2±2.6 53.7±3.9 20.7±7.3 32.5±11.4 42.3±7組別 bcl-2 3月齡 6月齡caspase-3 3月齡 6月齡caspase-9 3月齡 6.4 52.6±6.3模型組 18.4±4.1 41.8±4.2 39.8±11.7 67.3±11.7 65.4±8.9 77.3±10.5

圖3 APPswe/PSΔE9小鼠和正常對照小鼠中caspase-3和caspase-9的蛋白表達水平

3 討論

AD是一種神經系統退行性疾病，是導致老年人癡呆的主要疾病，大約有50% ～60%的癡呆癥患者都是由該病所導致的〔2〕。目前，AD的病因尚不明確，因此該病的治療仍然十分困難。關于AD發病機制的研究，最初主要集中在APP、PS等單一的基因上，但是隨著研究的不斷深入和進展，人們逐漸發現AD的發生是一個非常復雜的過程，各種因素(包括異常的凋亡)都有可能參與其中。早在上世紀90年代，就已經有學者開始研究凋亡與AD的關系〔3，4〕，而且越來越多的研究表明，異常的凋亡可能在AD的發生過程中起到非常重要的作用。APP是在阿爾茨海默病發病機制中被研究最多的一個蛋白，但是它的功能目前仍不明確，新的研究發現〔5〕，其胞內結構域可以影響一些基因的表達，從而誘導神經元特異性凋亡，這也進一步提示我們凋亡在AD的發病機制中可能具有重要作用。

bcl-2是一種抗凋亡蛋白，它可以抑制caspase-3和caspase-9的活化，而后兩者則是凋亡過程中至關重要的因子。本研究實驗以APPswe/PSΔE9小鼠作為AD的模型，檢測了其腦組織中bcl-2、caspase-3以及caspase-9的表達情況，結果顯示，APPswe/PSΔE9小鼠腦組織中，bcl-2表達水平明顯降低，而caspase-3和caspase-9水平則明顯升高，提示在AD中可能存在異常高水平的凋亡。一些研究發現，bcl-2是AD的一個保護性因子〔6～9〕，我們的實驗也在一定程度上間接支持了這一觀點。此外還有研究發現，caspase活化以后可以導致AD中神經系統的退行性改變〔10〕。由此，我們可以看出bcl-2、caspase-3以及caspase-9等凋亡相關蛋白與AD的關系十分密切。我們的實驗還發現，在3月齡APPswe/PSΔE9小鼠腦組織中就可以檢測到這些凋亡相關蛋白的異常表達，這提示我們異常的凋亡可能在AD的早期就已經存在，這將有助于我們研究AD早期的發病機理，為其早期診斷早期治療提供一定的幫助。

1 宗園媛，王曉映，王海林，等.APP/PS雙轉基因阿爾茨海默病小鼠模型的老年斑及行為學動態分析〔J〕.中國比較醫學雜志，2008;18(9):8-12.

2 Blennow K，de Leon MJ，Zetterberg H.Alzheimer's disease〔J〕.Lancet，2006;368(9533):387-403.

3 LaFerla FM，Tinkle BT，Bieberich CJ，et al.The Alzheimer's A beta peptide induces neurodegeneration and apoptotic cell death in transgenic mice〔J〕.Nat Genet，1995;9(1):21-30.

4 Su JH，Anderson AJ，Cummings BJ，et al.Immunohistochemical evidence for apoptosis in Alzheimer's disease〔J〕.Neuroreport，1994;5(18):2529-33.

5 Ohkawara T，Nagase H，Koh CS，et al.The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis〔J〕.Gene，2011;475(1):1-9.

6 Saillé C，Marin P，Martinou JC，et al.Transgenic murine cortical neurons expressing human Bcl-2 exhibit increased resistance to amyloid beta-peptide neurotoxicity〔J〕.Neuroscience，1999;92(4):1455-63.

7 Song YS，Park HJ，Kim SY，et al.Protective role of Bcl-2 on beta-amyloidinduced cell death of differentiated PC12 cells:reduction of NF-kappaB and p38 MAP kinase activation〔J〕.Neurosci Res，2004;49(1):69-80.

8 Ferreiro E，Eufrásio A，Pereira C，et al.Bcl-2 overexpression protects against amyloid-beta and prion toxicity in GT1-7 neural cells〔J〕.J Alzheimers Dis，2007;12(3):223-8.

9 Rohn TT，Vyas V，Hernandez-Estrada T，et al.Lack of pathology in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease after overexpression of the anti-apoptotic protein Bcl-2〔J〕.J Neurosci，2008;28(12):3051-9.

10 de Calignon A，Spires-Jones TL，Hyman BT.Caspase activation precedes and leads to neurodegeneration in a murine model of Alzheimer's disease〔J〕.Med Sci(Paris)，2010;26(10):787-9.