誘導型一氧化氮合酶、環氧合酶-2與乳腺癌淋巴管生成的關系及其臨床意義

黃玉鈿 張 聲 鄭 曦 吳欽穗 黃雙月

(福建醫科大學附屬福州市第一醫院病理科，福建 福州 350009)

淋巴道轉移是乳腺癌最重要的生物學行為之一，新近研究表明〔1〕，癌的淋巴道轉移不是一個被動的過程，癌間質淋巴管的生成與癌細胞的轉移密切相關。誘導型一氧化氮合酶(iNOS)〔2，3〕和環氧合酶(COX)-2〔4，5〕與腫瘤的侵襲轉移密切相關，我們采用原位雜交法檢測90例乳腺浸潤性導管癌組織和30例乳腺良性病變組織中iNOS和COX-2的mRNA表達情況，另以免疫組化法檢測乳腺癌組織中VEGF-C表達和淋巴管內皮透明質酸受體-1(LYVE-1)標記的淋巴管密度(LVD)，分析iNOS、COX-2與乳腺癌淋巴管生成的關系，探討兩者在乳腺癌淋巴道轉移中的作用機制及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2000至2006年存檔的乳腺浸潤性導管癌石蠟包埋組織90例，患者均為女性，年齡30～80歲，并以30例乳腺纖維腺瘤組織作為對照組，所有病例均有完整臨床資料，術前均未接受過放化療或免疫治療。乳腺癌組織病理學分級采用Bloom-Richardson系統Nottingham改良方案〔6〕;患者臨床分期按照TNM分期法(UICC，2003版)。

1.2 主要試劑與方法 iNOS和COX-2的mRNA寡核苷酸探針及原位雜交試劑盒購自武漢博士德生物公司，兔抗人多克隆抗體VEGF-C為美國Zymed公司產品(工作濃度為1∶150)，兔抗人多克隆抗體LYVE-1為英國Abcam公司產品(工作濃度為1∶100)，Elivision免疫組化試劑盒購自福州邁新生物公司。寡核苷酸探針原位雜交檢測和Elivision免疫組化檢測嚴格按照試劑盒步驟進行，均設立陽性及陰性對照。

1.3 結果判斷 iNOS、COX-2原位雜交檢測結果和VEGF-C免疫組化檢測結果的判定均采用半定量法:先將特異性定位于乳腺癌細胞質的染色按著色深淺打分:0分為無色、1分為淡黃、2分為棕黃、3分為棕褐;再將陽性細胞所占百分比打分:0分為陰性、1分為≤10%、2分為11% ～50%、3分為≥51%，兩種得分乘積≥3分為陽性表達。采用免疫組化檢測LYVE-1，其標記的LVD按照Schoppmann的方法〔7〕，LYVE-1陽性染色定位于淋巴管內皮細胞質，染成棕黃色的單個內皮細胞或內皮細胞簇形成無肌性或纖維性管腔結構均可計數為1個微淋巴管;在低倍鏡下選取5個微淋巴管密集區，然后在高倍鏡視野(HPF，×200)下計數微淋巴管的數目，取其平均值作為LVD(個/HPF)。

1.4 統計學處理 采用SPSS11.0統計軟件分析，計數資料比較采用χ2檢驗;計量資料比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 iNOS和COX-2 mRNA在乳腺癌中的表達情況 iNOS和COX-2 mRNA陽性表達位于乳腺癌細胞質上(見圖1)，兩者在乳腺癌組織中的表達陽性率分別為66.7%(60/90)，68.9%(62/90)，在良性對照組中陽性率分別為3.3%(1/30)，6.7%(2/30)，兩者在良惡性乳腺腫瘤中的表達差異均有統計學意義(P＜0.01)。iNOS mRNA表達與乳腺癌腫瘤大小、臨床分期呈正相關(P＜0.05)，在不同病理分級、年齡、有/無腋窩淋巴結轉移的分組中表達差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1。乳腺癌COX-2 mRNA表達與病理分級、淋巴結轉移、分期呈正相關(P＜0.05)，在不同腫瘤大小、年齡分組中表達差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1。乳腺癌中iNOS mRNA陽性組的COX-2 mRNA陽性表達率為76.7%(46/60)，而iNOS mRNA陰性組的COX-2 mRNA陽性率為53.3%(16/30)，iNOS和COX-2的mRNA陽性表達呈正相關(P＜0.05)。

2.2 乳腺良惡性腫瘤組織中LVD和VEGF-C蛋白表達的差異 LYVE-1陽性定位于乳腺癌間質淋巴管內皮細胞質(見圖1)，LYVE-1標記的乳腺癌LVD為(8.03±2.26)個/HPF，乳腺纖維腺瘤LVD為(1.86±0.97)個/HPF，差異顯著(P＜0.01)。VEGF-C蛋白表達于乳腺癌細胞質上(見圖1)，乳腺癌VEGF-C蛋白表達陽性率為47.8%(43/90)，乳腺纖維腺瘤VEGF-C陽性率為6.7%(2/30)，差異顯著(P＜0.01)。

2.3 iNOS mRNA在乳腺癌組織中的表達與LVD和VEGF-C蛋白表達的關系 乳腺癌iNOS陽性組LVD與iNOS陰性組LVD差異具有統計學意義(P＜0.01)。乳腺癌iNOS陽性組VEGF-C蛋白表達陽性率與iNOS陰性組VEGF-C陽性率差異具有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

2.4 COX-2 mRNA在乳腺癌組織中的表達與LVD和VEGF-C蛋白表達的關系 乳腺癌COX-2陽性組LVD與COX-2陰性組LVD差異具有統計學意義(P＜0.01)。乳腺癌COX-2陽性組VEGF-C蛋白表達陽性率與COX-2陰性組VEGF-C陽性率差異無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

表1 iNOS和COX-2 mRNA與乳腺癌患者臨床病理學參數的關系〔n(%)〕

表2 乳腺癌中iNOS和COX-2 mRNA與LVD及VEGF-C蛋白表達的關系

圖1 乳腺癌iNOS mRNA、COX-2 mRNA、LYVE-1、VEGF-C的表達(×400)

3 討論

iNOS是NO合成的關鍵酶，在正常生理條件下各組織細胞的iNOS活性幾乎不表達，當遇到細胞因子、致癌劑等因素時，無活性的單體聚合成二聚體從而獲得合成NO的能力;iNOS合成的NO濃度可導致氮氧自由基如N2O3的形成，后者可使胺硝化形成亞硝胺，誘發DNA突變從而引發腫瘤〔3〕。本研究結果表明乳腺癌中iNOS mRNA陽性率較良性組顯著提高，且iNOS mRNA陽性率隨乳腺癌腫瘤大小和分期的上升而增高，提示iNOS在乳腺癌的生長侵襲過程中起促進作用。

COX-2是催化花生四烯酸轉化為前列腺素(PGs)的重要限速酶，在正常組織中無表達，當受到各種生長因子、癌基因等因素刺激時COX-2得以迅速合成，COX-2的催化產物PGs能引起前致癌物發生環氧化反應成致癌物，啟動腫瘤的發生〔5〕。本研究顯示乳腺癌COX-2 mRNA陽性率較良性組顯著提高，COX-2 mRNA陽性率與乳腺癌分級、淋巴結轉移和分期呈正相關，提示COX-2能顯著提高乳腺癌細胞的侵襲轉移能力。iNOS和COX-2在正常條件下不表達，均需一定的病理因素誘導生成，本研究結果還顯示，乳腺癌組織中iNOS和COX-2兩種基因的mRNA陽性率呈正相關，表明在致癌因素的誘導下，兩者的轉錄合成具有協同作用，共同促進乳腺癌的發生發展。

LYVE-1是特異性表達于淋巴管內皮細胞上的CD44糖蛋白同系化合物，在血管內皮細胞上無表達，已有研究表明〔8〕，以LYVE-1標記乳腺癌間質內淋巴管并計算淋巴管密度(LVD)能有效反映乳腺癌的淋巴管生成水平，本研究結果顯示，乳腺癌LVD水平較乳腺纖維腺瘤顯著提高。VEGF-C基因定位于人染色體4q34，是重要的淋巴管內皮細胞特異性調節因子，能促進淋巴管的生成〔9〕。本研究顯示，乳腺癌組織中VEGF-C表達陽性率明顯高于良性對照組。以上關于LVD和VEGF-C的研究提示，淋巴管生成在乳腺癌的發生發展過程中扮演重要角色;本研究顯示iNOS與乳腺癌組織LVD水平呈正相關，且iNOS表達與VEGF-C呈正相關，提示iNOS能顯著提高乳腺癌組織VEGF-C的表達，VEGF-C的上調能使其與淋巴管內皮上的特異性受體VEGFR-3的結合得以增強〔10〕，刺激淋巴管內皮細胞生長，維持淋巴管的完整性，促進淋巴管生成，提高乳腺癌LVD水平，進而促使癌細胞通過淋巴管向周圍淋巴結轉移。研究結果還顯示COX-2與乳腺癌LVD水平呈正相關，但與VEGF-C無明顯相關，COX-2與iNOS均能提高乳腺癌的淋巴管生成水平，關于COX-2促淋巴管生成的途徑有待進一步研究，但兩者均有望作為抗乳腺癌淋巴管生成的靶點應用于乳腺癌的臨床治療。

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