土生曲霉轉化三七中藥材的研究

陳有為，苗翠蘋，吳少華

云南大學省微生物研究所，西南微生物多樣性教育部重點實驗室，昆明650091

三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)系五加科Araliaceae植物三七的根，為我國云南傳統中藥材之一［1］。三七的藥用成分與人參所含皂甙類似，主要為人參皂甙Rb1，Re，Rg1，但Rc含量較人參為低，且不含人參皂甙R［2］。三七總皂甙水解后，主要得人參三醇，其次為人參二醇，未檢出齊墩果酸［3］。現代藥理實驗表明，三七皂甙有效成分具有廣泛的生理活性，臨床證明具有多種功能，如治療心血管及血液造血系統疾病，中樞神經系統病變，抗腦缺血及抗腫瘤的作用，消炎止痛，肝損傷治療以及代謝消化系統保護等［4］。基于三七的藥理作用及其豐富資源，我們從云南不同地區土壤真菌中，通過篩選分離獲得直接轉化三七中藥材的微生物。本文首次報導以傳統中藥材三七為原料，通過土生曲霉菌Aspergillus terreus的轉化作用，可導致原三七化學成分發生變化，大部分化學成分被降解或分解，而三七中藥材具有生理活性的部分原化合物如三七皂苷nR2及人參皂苷Rg1、Rd、Rh1等含量大幅度提高。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

土生 曲 霉 Aspergillusterreus(菌 株 編 號YM31966，保藏號CCTCC NO:M202016)，分離自云南西雙版納自然保護區熱帶雨林土壤中，云南省微生物研究所保存。

1.1.2 培養基

菌種保藏培養基:麥芽汁培養基。(1)活化斜面培養基:PDA固體培養基。(2)擴大培養基:PDA液體培養基。(3)三七轉化培養基:三七粉(顆粒80～100目)，水份65%～70%，PH自然。

1.1.3 轉化方式

固態轉化。

1.1.4 試劑與儀器

中藥材三七(云南文山)。三七皂甙(nR2≥99%)與人參皂甙(Rg1≥98%、Rd≥99%、Rh1≥99%、Rh4≥99%)標準品由中科院昆明植物研究所提供。乙醇(食用級≥95%)，丙酮、氯仿、甲醇實驗試劑均為分析純，乙腈(色譜級)。D-101和D-72大孔樹脂(天津)，薄層色譜(TLC)硅膠G和柱層析硅膠(青島)，反相柱層析填料RP-18(40-75 um，Merck)，凝膠(Sephadex LH-20)。光學顯微鏡Olympus BH-22，旋轉蒸發儀EYELA，紫外光譜儀Shimadzu double-beam 210A，紅外光譜儀Bio-Rad FTS-135，高效液相色譜儀Waters HPLC，超導核磁共振儀Bruker DRX 500，質譜儀VG AutoSpec-3000型。

1.2 菌株篩選與鑒定

從云南西雙版納自然保護區土壤分離獲得的絲狀真菌中，采用固態轉化方式，逐一進行三七的微生物轉化篩選試驗，經TLC與HPLC檢測，獲得能夠直接轉化三七的高效菌株。該菌株以麥芽汁、PDA與察氏培養基，28℃培養不同時間觀察菌落和顯微特征，結合文獻［6，7］方法確定菌株的系統學地位。

1.3 微生物的轉化

以固態轉化方式［8］，將活化好的菌種斜面接入三角瓶中(100 mL液體PDA培養基/500 mL三角瓶)，置28℃±2℃、200 rpm搖床培養4 d得種子液，按10%接種量接入三七轉化培養基(100 g/500 mL玻璃瓶)，28℃±2℃靜止10 d轉化后得轉化產物。

1.4 轉化產物提取

轉化產物采用濃度60%乙醇(m/v:1∶8)浸提48h，收集合并浸提的轉化產物浸提液，經D-101大孔樹脂層析柱吸附，純凈水沖洗大孔樹脂層析柱后，采用梯度乙醇(濃度70%～90%)洗脫，洗脫液經旋轉蒸發儀揮去乙醇得粗提液。粗提液再經D-72大孔樹脂層析柱脫色，濃度80%乙醇洗脫，脫色后的洗脫液經濃縮得濃縮液。濃縮液按1∶8(v/v)比例加入濃度95%乙醇，室溫下放置12 h，過濾棄沉淀物，濾液于40℃下經減壓濃縮、干燥后即得三七轉化產物總皂甙。

1.5 化合物的分離

三七轉化總皂甙(100 g)經硅膠柱層析，用氯仿-甲醇-水(9∶1∶1～6∶4∶1)梯度洗脫，得到At-1 (19.8 g)、At-2(20.2 g)、At-3(13.5 g)、At-4(22.1 g)、At-5(18.9 g)和At-6(16.8 g)六個組分。組分At-1通過硅膠柱色譜(氯仿-甲醇-乙酸乙脂-水(2∶2∶4∶1)、凝膠Sephadex LH-20柱色譜(氯仿-甲醇9∶1～8∶2)得到化合物nR2(80 mg)。組分At-2通過硅膠柱色譜(氯仿-甲醇9∶1～6∶4)、凝膠Sephadex LH-20柱色譜(氯仿-甲醇8∶2～7∶3)分離得到化合物Rg1(220 mg)。組分At-3通過硅膠柱色譜(氯仿-甲醇-水9∶2∶1～8∶2∶0.5)、凝膠Sephadex LH-20柱色譜(100%甲醇)和反向RP-18柱層析(甲醇-水8∶2～1∶0)分離得到化合物Rh1(38 mg)。組分At-4通過硅膠柱色譜(氯仿-甲醇9∶1～6∶4)、凝膠SephadexLH220柱色譜(100%甲醇)和反相RP-18柱層析(甲醇-水8∶2～1∶0)分離得到化合物Rd(201 mg)。組分At-5通過硅膠柱色譜(氯仿-甲醇-水7∶3∶0.5)、凝膠SephadexLH220柱色譜(100%甲醇)和反相RP-18柱層析(甲醇-水8∶2～1∶0)分離得到化合物Rh4(36 mg)。組分At-6通過硅膠柱色譜(氯仿-甲醇-水8∶2∶0.5)、凝膠 Sephadex LH-220柱色譜(100%甲醇)和反相RP-18柱層析(甲醇-水7∶3～1∶0)分離得到化合物RX1(25 mg)。

1.6 轉化產物的檢測

1.6.1 TLC

展開劑:氯仿-甲醇:水7∶3∶0.5，顯色劑(乙醇-硫酸)，對照樣品原三七提取物。

1.6.2 HPLC

色譜柱Symmetrym C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)。流動相為乙睛-水98∶2，流速1 mL/min，檢測波長203 nm，柱溫常溫［9］。分析樣品的制備精確稱取三七皂苷nR2及人參皂苷Rg1、Rd、Rh1和Rh4標準品各3 mg，三七轉化總皂苷50 mg，分別置10 mL容量瓶中，甲醇定容。

1.6.3 波譜分析

轉化產物提取總皂苷分離各化合物經紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、1H核磁共振(1H NMR)、13C核磁共振(13C NMR)等波譜測定轉化產物各化合物結構組成［10-12］。

1.6.4 質譜(MS)

用于三七轉化產物總皂苷各化合物分子量的測定［13］。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定

菌株YM31966在PDA培養基上，28℃培養6 d，菌落直徑28 mm，12 d 38 mm。菌落淺咖啡色，扁平疏松粉狀，邊緣稍不整齊，中間凸起，背面黃褐色，具同心環。麥芽汁培養基28℃培養6 d，菌落直徑33 mm，12 d 40 mm。菌落扁平疏松，淺咖啡色粉狀，邊緣不齊，中部有放射溝紋，背面褐色。察貝克培養基28℃培養6 d，菌落直徑23 mm，12 d 37 mm。菌落淺黃帶肉紅色，粉狀中間絨狀，稍緊密，邊緣不齊，有黃色水珠。背面橘紅色，稍具溝紋(見圖1)。

菌株YM31966菌絲無色，有隔膜。分生孢子梗從壁厚而膨大的足細胞垂直生出，光滑無色;頂囊半球形，頂部2/3密生小梗;小梗雙層;分生孢子穗圓筒形，肉桂色;分生孢子球形光滑。孢子直徑1.8微米(見圖1)。

圖1 土生曲霉(A.terreus)YM31966菌落圖片和菌株顯微圖片Fig.1 Photographs of colonia and morphological micrograph from A.terreus YM31966

YM31966菌株18S rDNA序列全長為1729 bp，經建立系統進化樹分析，并與Blast與Gene Bank中的核酸數據進行比對，結果可觀察到該菌株與土生曲霉(Aspergillus tamarii)的序列相似性無差異。

土生曲霉(A.terreus)YM31966菌株在以中藥材三七為原料的轉化基質上，培養2 d長滿白色菌絲，菌絲短，發酵物結塊。培養4 d大量土紅色孢子生長，發酵物緊密呈土黃色。培養6 d發酵物表面長滿土紅色孢子，發酵物上部分呈土色，下部分呈土黃色。培養8 d發酵物表面長滿粉粉的土紅色孢子，發酵物上五分之四左右部分呈土色，下五分之一左右部分呈土黃色。培養10 d后發酵物上部分呈米糠色，下部分呈黃綠色，發酵物致密，表面長滿糠麩色孢子，靠近瓶底部分呈黃綠色。

2.2 轉化產物

2.2.1 三七轉化產物組分

以中藥材三七為基質，經土生曲霉(A.terreus) YM31966菌株的轉化作用，三七轉化產物總皂苷成分的組成及化學成分的變化見圖2和表1所示。

圖2 土生曲霉(A.terreus)YM31966菌株轉化三七產物皂甙組分的TLC及HPLC分析Fig.2 The HPLC and TLC graph of compounds from converted Panax notoginseng by A.terreus YM31966

表1 土生曲霉(A.terreus)YM31966菌株對三七化學成分的轉化影響Table 1 Effect on converted compounds of Panax notoginseng by A.terreus YM31966

從圖2和表1中可看出，與原三七比較，土生曲霉(A.terreus)YM31966菌株轉化三七產物主體成分由三七皂苷nR2、RX1及人參皂苷Rd、Rg1、Rh1和Rh4組成。大部分原三七化學成分被該菌株降解，例如原二醇型人參皂苷Rb1、Rc、RY-XVII、nFa及原三醇型人參皂苷Re及三七皂苷nR1、nR3、nR6等成分消失。其中，原二醇型人參皂苷Rd化合物占三七轉化產物皂苷總成分的14.06%;人參皂甙Rg1化合物占總成分的51.09%;化合物Rh1為4.8%;而Rh4及RX1化合物分別占總成分的0.5%，相比原三七對應成分其含量得到大幅度提高。

2.2.2 三七轉化產物的化合物結構

從三七轉化產物總皂甙成分中分離獲得6個化合物，分別對轉化三七產物的化合物進行 UV、IR、1H NMR、13C NMR及MS等波譜分析，結果At-(1～4)四個化合物的結構分別與原中藥材三七皂苷nR2及人參皂甙Rg1、Rh1和Rd的化學結構完全一致［14-16］。At-5化合物為紅參特有成分人參皂苷Rh4［17］，而 At-6化合物為轉化獲得的另一新化合物，暫定名三七皂苷RX1(Notoginsenoside RX1)。

化合物 At-1:三七皂甙 nR2(notoginsenoside R2)，分子式C41H72O13，分子量772，熔點(mp)186～188℃，［α+10.30°(c 1.0，MeOH)。化合物At-2:人參皂甙Rg1(ginsenoside Rg1)，分子式C42H72O14，分子量800，熔點(mp)201～203℃，［α+ 22.30°(c 1.3，MeOH)。化合物At-3:人參皂甙Rh1(ginsenoside Rh1)，分子式C36H62O9，分子量638，熔點(mp)190～192℃，［α+20.0°(c 0.80，MeOH)。化合物 At-4:人參皂甙 Rd(ginsenoside Rd)，分子式C48H82O18，分子量946，熔點(mp)206～208℃，［α+19.5°(c 1.03，MeOH)。化合物At-5:人參皂甙Rh4(ginsenoside Rh4)，分子式C36H60O8，分子量620.43(Molt Wt620.86)。化合物At-6:三七皂苷RX1(notoginsenoside RX1)，分子式C36H60O8，分子量620.43(Molt Wt620.86)，如圖3所示。

圖3 土生曲霉(A.terreus)YM31966菌株轉化三七產物的化合物結構Fig.3 Structures of compounds from converted Panax notoginseng by A.terreus YM31966

3 討論

本研究分離獲得可直接轉化三七中藥材的微生物土生曲霉(A.terreus)YM31966菌株，以云南文山三七中藥材為原料，通過該菌的轉化作用，結果表明可分解或修飾原三七皂苷成分的組成和含量，出現新化合物三七皂苷RX1及新成分人參皂苷Rh4，轉化產物使得原藥材的生物活性作用得到進一步的增強成為可能，這為中草藥或天然藥物新藥成分的發現開辟了一條途徑。

與三七原中藥材比較，土生曲霉(A.terreus) YM31966菌株的三七轉化產物總皂苷分別由人參二醇型皂苷Rd及原人參三醇型皂苷由nR2、Rg1、Rh1、Rh4和RX1苷元構成。原人參二醇型皂苷Rd含量提高了85%左右;原三七人參二醇型皂苷Rb1、nR4、RY-XVII、nFa等化合物消失。原人參三醇型皂苷Rg1化合物含量平均增加48%;人參皂苷Rh1和nR2化合物含量分別提高35.2%和13.9%，而人參皂苷Re和三七皂苷nR1、nR3、nR6等化合物被分解消失。表明該菌轉化三七不僅可使原三七化合物種類組成發生變化，也能促使原三七某些化學成分含量增長。在分析中藥材三七轉化產物化合物的結構時，結果也證實皂苷Rd、nR2、Rg1、Rh1的化學結構與三七原中藥材人參皂苷和三七皂苷成分的化學結構一致。而Rh4是首次從三七轉化產物中分離得到的人參皂甙，RX1是土生曲霉(A.terreus)YM31966菌株直接轉化三七形成的三七皂苷新化合物。

關于三七中藥材的微生物轉化物質途徑與微生物酶反應直接相關。人參二醇型皂苷Rd來源于三七皂苷Rb1經土生曲霉(A.terreus)YM31966菌株β (1→2)葡萄糖苷酶分解葡萄糖形成。人參皂苷Rh1是由三七皂苷R2經該菌β(1→2)木糖酶分解木糖形成。通過β(1→2)木糖酶分解三七皂苷R2木糖，再經脫氫酶發生羥基化反應轉化成人參皂苷Rh4和三七皂苷RX1，區別在于人參皂苷Rh4為三七皂苷R2甾醇結構20位碳原子上配糖體R2=H發生羥基化反應，而三七皂苷RX1則是三七皂苷R2甾醇結構21位碳原子上配糖體R2=H發生羥基化反應，經脫氫作用形成雙鍵。有關人參皂苷Rg1數量的增加則是由部分三七皂苷R1配糖體結構經該菌β(1→2)木糖酶分解木糖所導致，其轉化物質途徑的機理還有待進一步研究。

1 Zhou ZH(周志華).Analysis of Saponins Constituents from Panax notoginseng.Act Pharm Sin(藥學學報)，1981，16: 216-219.

2 Wei JX(魏均嫻)，Chen YG(陳業高).Progress on Saponins of Dammarane Type，Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，1998，25:205-208.

3 Zhao P(趙平)，Liu YQ(劉玉清)，Yang CR(楊崇仁).Minor Costituents from the Roots of Pananx Notoginseng(1).Acta Botanica Yunnanica(云南植物研究)，1993，15:409-412.

4 Chen YP(陳燕平)，Meng Q(孟勤)，Song CC(宋長春)，et al.Preparation of 20(S)-protopanaxadiol saponins and 20 (S)-ginsenoside-Rh2from 20(S)-protopanaxadiol saponins.Chin Pharm J(中國藥學雜志)，1997，32:273-275.

5 Cong DL(叢登立)，Song CC(宋長春)，Xu JD(徐景達).I-solation and Identification of 20(S)-Ginsenoside-Rh1，-Rh2and Ginsenoside-Rh3from the leaves of panax Scinquefolium.Chin Pharm J，2000，35:82-83.

6 Qin S(秦盛)，Chen YW(陳有為)，Xing K(邢珂)，et al.I-solation，Identification and Bioactivity Screening of Endophytic Fungus Assiciated with Opuntia ficusindica Mill.Microbiology(微生物學通報)，2006，33:95-99.

7 Kirk PM，Cannon PF，David JC，et al.Ainsworth＆Bisby’s dictionary of the Fungi，Ninth Edition 2001，p47-48.

8 Zhang CH(張傳會)，Chen YW(陳有為)，Zheng Y(鄭毅)，et al.Preparation of diosgeninby microbial transformation of dioscorea panthaica by YM32139 Strain.J Microbiol (微生物學雜志)，2007，27:31-34.

9 Wang D(王東)，Li HZ(李海舟)，Chen KK(陳可可)，et al.HPLC comparative analysis of ginsenoside saponins in different underground parts of Panax notoginseng.Acta Botanica Yunnanica(云南植物研究)，2005，6:287-289.

10 Li HZ(李海舟)，Zhang YJ(張穎君)，Yang CR(楊崇仁).A Further Investigation on the Chemical Constituents from the Leaves of Panax notoginseng.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2006，4:131-233.

11 Zeng J(曾江)，Cui XM(崔秀明)，Zhou JM(周家明)，et al.Studies on Chemical Constituents from Rhizomes of Panax notoginseng.J Chin Med Mat(中藥材)，2007，1:7-9.

12 Yuan YQ(袁延強)，Chen XQ(陳錫強)，Hou HR(侯海榮)，et al.Research on Dammarane Saponins of Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen(Ⅱ).Shandong Science(山東科學)，2009，4:276-279.

13 Zhou J.Dammarane-saponins of Sanchi-Ginseng，roots of Panax notoginseng(Buek.)F.H.Chen:Structure of new saponins，notoginsenoside-R1and-R2and identification of Ginsenoside-Rg2and-Rh1.Chem Pharm Bull，1981，29:2844.

14 Kazuhiro Hirakura.Phytochemistry，1992，31:889-903.

15 Kazuhiro Hirakura.Phytochemistry，1993，35:963-967.

16 Masayaki Yoshikawa.Chem Pharm Bull，1998，46:647-654.

17 Hideaki M，Kensuke N，Seiya F，et al.Effects of Red Ginseng on ExperimentalDisseminated IntravasularCoagulation.Chem Pharm Bull，1986，34:2100-2104.