藍莓提取物對副溶血性弧菌的抑制作用

謝慶超，孫曉紅*，沈 瀟，Vivian C.H.Wu，潘迎捷

1上海海洋大學食品學院上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海201306; 2美國緬因大學食品科學與人類營養系，緬因04469

副溶血性弧菌(又稱嗜鹽菌，Vibrio parahaemolyticus)作為常見的食源性致病菌之一，廣泛地分布于蝦、蟹等海產品中，人們食用經副溶血性弧菌污染的海產品后易產生腹瀉等腸胃疾病。以2007年上海市腸道疾病調查為例，由食源性致病菌導致的腸道疾病占總腸道疾病的12.82%，其中副溶血性弧菌引發的疾病占76.92%［1］。曹慧慧等［2］對國內8個沿海城市大型水產品批發市場零售的貝類產品檢測發現，62.67%的樣品呈tlh陽性，即存在副溶血性弧菌污染。由于副溶血性弧菌多存在于海水中，進入海產品后很難被清除，人們又喜愛食用生或者半生的海產品，因此明顯加劇了感染副溶血性弧菌的風險。

目前常用的水產品保鮮劑如山梨酸鉀等化學保鮮劑由于其安全衛生問題引起人們的擔憂，因此，具有抑菌功能的天然活性物質開始受到人們的重視［3-5］。藍莓，又稱越橘，不僅具有良好的營養保健作用，還具有防止腦神經衰老［6］、增強心臟功能、明目及抗癌等獨特功效，因此被國際糧農組織列為人類五大健康水果之一。目前國內外對藍莓活性物質研究集中在花青素［7］的分離提取和對人體功能、消化吸收及體內代謝等方面，對藍莓的抑菌活性研究少有報道。目前已見報道的研究僅有:Ofek等［8］研究發現藍莓汁可破壞大腸桿菌細胞膜，造成菌體受損死亡。QIU等［9］用藍莓提取液處理漢堡中的牛肉能顯著延長漢堡的貨架期，且其感官品質未明顯變化。陳玉峰等［10］研究發現，藍莓果實中的花色苷對大腸桿菌有一定的抑制作用。然而，藍莓對副溶血性弧菌的抑制作用尚未見報道?；诖耍疚膬灮怂{莓抑菌活性物質的提取工藝，并對副溶血性弧菌的抑菌效果進行研究，為藍莓天然生物保鮮劑的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

藍莓(Vaccinium corymbosum L.)品種為高叢藍莓(High bush blueberry)埃利奧特(Alliot)，購自沃林(Wallin)農業青島有限公司，保存于-20℃冰箱。

副溶血性弧菌ATCC33847購自于美國ATCC菌種保藏中心。

1.1.2 試劑

無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)，TSB (3%NaCl)培養基與TCBS培養基(北京陸橋技術有限責任公司)。

1.1.3 主要儀器

8010s勻漿機(Waring Commerial)，pl2002電子天平(Mettler Toledo)，SK5200HP超聲波清洗機(上?？茖С暡▋x器有限公司)，GG17旋轉蒸發儀(SENCO)，QB9006微孔板快速振蕩器(金壇市醫療儀器廠)，3799 96孔板(Corning Incorporated)。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

稱取藍莓5 g→快速解凍→勻漿→超聲波提取→離心→布氏漏斗過濾→0.22 μm濾膜過濾→旋轉蒸發濃縮至5 mL(其濃度即為1 g/mL)放于-20℃備用。

由于進行的是抑菌效果的驗證，因此未考慮增加提取次數以提高得率。

1.2.2 超聲波法提取藍莓有效成分正交試驗［11］

進行三因素四水平正交試驗，按正交表L16(43)對乙醇濃度、提取溫度、提取時間進行研究，每個因子4個水平，每個處理3次重復，具體見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Design of orthogonal experiment

1.2.3 藍莓提取物pH值測定

采用pH計測定16種提取方法得到的藍莓提取物的pH值。

1.2.4 副溶血性弧菌菌液制備

取斜面保藏的菌株，用TSB(3%NaCl)培養基活化兩次。取1 μL菌液加入到10 mL TSB(3% NaCl)培養基中進行稀釋，使菌液濃度達到 104CFU/mL。

1.2.5 藍莓提取物對副溶血性弧菌抑制實驗［12］

每個處理各取100 μL濃度分別為100和40 mg/mL的藍莓提取液(1 g/mL原液經無菌水稀釋)加入到96孔板兩個孔中，再各取100 μL稀釋后的菌液與藍莓提取液混合，30℃振蕩培養24 h。每個孔各取100 μL混合液涂布于TCBS培養基上，37℃培養24 h，計算每毫升菌落數。陽性對照采用100 μL山梨酸鉀(0.5 g/kg)與菌液混合，空白對照采用無菌水代替藍莓提取液與菌液混合(等同于陰性對照)。每個處理兩個平行，實驗重復3次。

1.2.6 數據處理

實驗數據均采用三次平行實驗的平均值，數據用Excel軟件處理，數據間的差異通過統計軟件SPSS13.0進行單因變量多因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同提取條件下藍莓提取物抑菌正交試驗結果

2.1.1 16種藍莓提取物抑菌效果

采用不同條件提取獲得的100和40 mg/mL的藍莓提取液對副溶血性弧菌的抑菌效果如表2所示，當藍莓提取物濃度為100 mg/mL時，處理組合A1B2C2、A1B4C4、A2B1C2、A2B2C3、A3B1C3、A3B2C4、A3B3C1和A3B4C2的抑菌率為100%，無法進行組內的有效比較。因此以40 mg/mL藍莓提取物的抑菌率為考察指標，綜合各因素K值結果，得出理論上最優條件為A4B3C1。影響藍莓抑菌效果的因素排序為:C＞B＞A，即提取溫度＞超聲波時間＞乙醇質量分數。

2.1.2 不同因素對藍莓提取物抑菌效果影響的比較

以抑菌率作為因變量，采用SPSS13.0對藍莓提取物濃度為40 mg/mL的實驗結果進行單因變量多因素方差分析，同時使用F檢驗對比三次重復，結果表明重復間差異不顯著。從表3可以看出，C因素(溫度)間差異顯著(p=0.024)，說明不同的提取溫度對藍莓提取物抑菌效果影響最大，B因素(時間)間差異顯著(p=0.069)，說明不同提取時間藍莓提取物抑菌效果影響比較大，A因素(乙醇質量分數)間差異不顯著(p=0.710)，藍莓提取物抑菌效果影響不大，分析結果與正交試驗結果一致。B因素和C因素各水平間均達到差異顯著，說明提取溫度和時間的不同對藍莓抑菌活性有顯著的差異，需進行區組內的多重比較。

表2 16種提取方法所得藍莓提取物的24 h抑菌率Table 2 Inhibitory rate after 24 h under the 16 extract methods of blueberry

表3 抑菌效果的方差分析Table 3 Analysis of variance with the results of 24h inhibitory effects

2.1.3 最優提取條件的獲得

以抑菌率作為評估標準，采用SPSS13.0進行各因素內不同水平的多重比較。圖1中顯示的是各因素內估計邊際均值的比較，可以比較各水平的邊際均數。由于實驗中是以抑菌率作為因變量，因此均值越高則表明抑菌效果越好。由圖1可以看出，A3、B3、C1在各自因素內有最好的抑菌效果，因此最優組合為A3B3C1，即采用質量分數為65%的乙醇溶液作為提取劑，超聲波提取25 min，提取溫度為30℃所得到的藍莓提取物抑菌效果最佳。為比較正交試驗獲得的最優組合與SPSS13.0分析獲得的最優組合，按照兩種提取方法重復提取3次，測得A4B3C1的抑菌率為78.2%，A3B3C1為81.3%，表明乙醇濃度65%，超聲波提取時間25 min，提取溫度30℃是最優的提取條件。

圖1 24 h抑菌效果的多重比較結果Fig.1 Multiple comparisons with the results of inhibitory rate

2.2 不同提取條件下藍莓提取物pH值

通過比較16組藍莓提取物的pH值可以看出，第11組pH值最低，僅為2.764，第3組pH值最高，達到了2.984。針對pH值較低的問題，又添加一組與最低pH值相同的HCl溶液作為處理液處理同樣菌數的副溶血性弧菌，結果發現處理24 h后，菌數高達7.11 log CFU/mL，將提取物pH值回調至7，再次研究其抑菌效果，發現提取物無抑菌效果，說明藍莓提取物的抑菌活性與提取物中的酸性物質沒有直接關系。但本實驗得到的抑菌最優組合同時具有相對較低的pH值，可能藍莓中的活性物質要在低pH值下才能發揮最好的抑菌效果。

圖2 16種提取方法所得藍莓提取物的pH值測定結果Fig.2 pH determination under the 16 extraction methods of China Blueberry

3 討論及結論

孟凡麗［13］、楊桂霞［14］和柳嘉［15］分別提取并鑒定了藍莓果中花色苷、黃酮及多酚類物質。其中，花色苷是藍莓提取物的主要著色成分，在較低的pH下花色苷才有較高的穩定性。本研究中我們也推測提取物中可能包含有一些酚酸類物質。在今后的實驗中可以對提取物進行分離純化，鑒定其主要成分，并研究各成分的抑菌功能。

近年來我國發生的食品安全事件層出不窮，透過這些事件，消費者對食品加工過程中使用的防腐保鮮手段感到極大恐懼。因此，如何讓人們食用安全健康的食品是我國廣大食品生產廠家以及科研工作者認真面對的問題。基于天然活性物質而開發新的防腐保鮮手段是最優也是最合理的解決方法。對于水產品，也有人研究了一些生物保鮮手段用以取代傳統的化學保鮮方法。Fan［16］等人的研究表明在-3℃條件下噴淋0.2%的茶多酚能有效延長白鰱魚的保鮮期，但是茶多酚很容易被氧化而且脂溶性不很理想，因此限制了其發展。王秀娟［17］等人研究了殼聚糖涂膜對蝦的保鮮作用，發現保質期比未涂抹的蝦延長了2～3 d，但殼聚糖保鮮膜效率低、難干燥、制膜強度差，且殼聚糖本身的澀味也降低了其使用率。本研究中得到的藍莓提取物可以有效抑制副溶血性弧菌的生長，脂溶性好，本身具有清香，能改善口味，同時還具有抗氧化抗衰老等營養功能，缺點則是需要較低的pH值環境。

本研究以北高叢藍莓中的栽培品種埃利奧特為材料，利用三因素四水平正交實驗提取抑菌活性物質，最終確定最優提取條件是65%的乙醇(w/w)作為提取劑、溫度為30℃，超聲波時間為25 min。影響藍莓抑菌效果的因素排序為:提取溫度＞超聲波時間＞乙醇質量分數。本研究為進一步研究藍莓提取物對真實樣品的抑菌效果及對副溶血性弧菌的抑菌機理研究提供了依據。

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