凹葉厚樸抑制α-糖苷酶與抗氧化活性研究

曹乃鋒，康文藝

1河南大學中藥研究所;2河南大學研究生院，開封475004

凹葉厚樸 (Magnolia Officinalis Rehder et Wils.)為木蘭科木蘭屬植物，藥用干皮、枝皮及根皮。其性溫、味苦、辛。具燥濕消痰、下氣除滿之功效，用于濕滯傷中、脫痞吐瀉、食積氣滯、腹脹便秘、痰飲喘咳［1］。主要成分為厚樸酚 (magnolol)與和厚樸酚(honokiol)［2］，包括異喹啉類生物堿以及揮發油［3-5］。Lee等［6］2009年報道了厚樸正丁醇提取物和4-O-甲基和厚樸酚具有抗氧化和保護神經的作用;Choi等［7］2009年報道了厚樸酚通過激活PPARr配體來提高胰島素的敏感性;Park J等［8］報道了厚樸具有廣譜抗菌等作用;Young Sook Kim等［9］通過研究發現高糖和S100b蛋白可誘導TGF-β1和纖維連接蛋白的表達，但厚樸酚能通過人體視網膜色素上皮細胞的ERK/MAPK/AKt信號通道來抑制這種增強的表達。Kenji I等［10］研究發現和厚樸酚在骨髓的微環境內能夠抑制血管形成，并且能夠殺死耐藥的多發性骨髓瘤細胞。

本文對貴州與河南產凹葉厚樸抑制α-葡萄糖苷酶活性和總抗氧化能力進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凹葉厚樸分別于2008年7月采集于河南省桐柏山，2009年7月采集于貴州省貴陽市。分別經河南大學天然藥物研究所生藥教研室李昌勤副教授和貴陽中醫學院劉凡教授鑒定為木蘭科木蘭屬植物Magnolia Officinalis Rehder et Wils，標本存于河南大學中藥研究所。

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，EC 3.2.1.20);4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-N-trophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG，026K1516);阿卡波糖(Acarbose，Lot 16869)和二甲亞砜(DMSO)均購自美國Sigma公司。DPPH(日本東京化成工業株式會社)，ABTS(Fluka)，Fe3+-三吡啶三啞嗪(tripyridyl-triazine，TPTZ)、沒食子酸丙酯(propyl gallate，PG)、丁基羥基茴香醚(Butylatedhydr oxyanisole，BHA)、二丁基羥基甲苯(Butylatedhydr oxyt oluene或2，6-Ditert-butyl-4-methyl phenol，BHT)(Acros organics)，6-羥基2，5，7，8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸 (6-hydroloxy-2，5，7，8-tetramethyl-chroman-2-carboxylic acid，Tr olox)(Aldrich)。

1.2 儀器

Multiskan MK3酶標儀(美國Thermo Electron公司);LRH-150恒溫培養箱(上海一恒科技有限公司);DELTA 320型PH計(美國Mettler-Toledo公司)。

1.3 凹葉厚樸浸膏的提取

貴州產凹葉厚樸葉325 g和河南產凹葉厚樸葉202 g分別干燥、粉碎后，用甲醇室溫下冷浸3次，每次7天。合并提取液后濃縮，浸膏分散水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別得到石油醚提取物8.6和4.1 g、乙酸乙酯提取物12.5和6.1 g、正丁醇提取物12.5和10.7 g。

1.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性的篩選方法

以康文藝等［11］建立的96微孔板篩選方法，405 nm處檢測其OD值。并按照以下公式求出酶活性抑制率。

然后用Origin軟件，以質量濃度為橫軸，抑制率為縱軸作圖，求出相應的半數抑制濃度(IC50值)。

1.5 抗氧化活性測定方法

DPPH法:按照文獻［12］的方法，在 515 nm處檢測樣品吸光度;ABTS法:按照文獻［13］的方法，在734 nm處檢測樣品吸光度;FRAP法:按照文獻［12］的方法，在 593 nm處檢測樣品吸光度，結果以 c (Trolox)表示。

2 結果與討論

2.1 貴州與河南產凹葉厚樸α-葡萄糖苷酶抑制活性

2.1.1 提取物活性的篩選

所有提取部位中，貴州產凹葉厚樸葉乙酸乙酯的α-葡萄糖苷酶的抑制活性最高(IC50=7.22 μg/ mL)，其正丁醇提取部位(IC50=36.59 μg/mL)、河南產凹葉厚樸石油醚部位(IC50=107.04 μg/mL)和乙酸乙酯部位(IC50=17.17 μg/mL)的活性均高于陽性對照Acarbose(IC50=1081.27 μg/mL)。

2.1.2 提取物濃度對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

圖1顯示，凹葉厚樸提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性呈劑量依賴性，而且，當抑制率達到一定程度時，再增加提取物質量濃度，抑制活性不會提高。其中，貴州產凹葉厚樸乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物在0.4 mg/mL時，達到最大抑制率，再增加提取物濃度，抑制率不再變化。河南產凹葉厚樸石油醚提取物和乙酸乙酯提取物在0.8 mg/mL時達到最大抑制率。

圖1 提取物濃度對α-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.1 The mass concentration of extracts effect on α-glucosidase inhibitory activity

2.2 貴州與河南產凹葉厚樸抗氧化活性

2.2.1 DPPH法

凹葉厚樸6個提取部位中，石油醚部位(河南)清除DPPH自由基的能力最強 (IC50=13.63 μg/ mL)，乙酸乙酯部位(貴州)次之(IC50=13.74 μg/ mL)。河南與貴州產凹葉厚樸提取部位與陽性對照PG、BHA、BHT對 DPPH自由基的清除能力順序為:PG(IC50=0.81 μg/mL)＞BHA(IC50=2.28 μg/mL)＞BHT(IC50=3.69 μg/mL)＞正丁醇部位(河南)(IC50=13.63 μg/mL)＞乙酸乙酯部位(貴州)(IC50=13.74 μg/mL)＞乙酸乙酯部位(河南)(IC50=20.21 μg/mL)＞正丁醇部位(貴州)(IC50=44.49 μg/mL)。

圖2顯示，河南產凹葉厚樸正丁醇提取物清除DPPH自由基的能力強于貴州產凹葉厚樸正丁醇提取物;河南產凹葉厚樸乙酸乙酯提取物清除DPPH自由基的能力與貴州產凹葉厚樸乙酸乙酯提取物能力相當;但弱于陽性對照PG、BHA和BHT。在實驗濃度范圍內，河南和貴州產凹葉厚樸乙酸乙酯提取物質量濃度在25 μg/mL以下時，DPPH自由基清除率隨質量濃度增大幾乎呈線性增加，當質量濃度在25 μg/mL以上時，清除率幾乎不變。貴州和河南產凹葉厚樸乙酸乙酯提取物清除DPPH自由基的能力與其濃度呈線性關系(相關系數分別為0.99765和0.99552)。

圖2 抗氧化劑質量濃度對DPPH自由基的影響Fig.2 Effect of mass concentration of antioxidant on DPPH free radical

2.2.2 ABTS法

乙酸乙酯部位(貴州)清除ABTS自由基的能力最強(IC50=8.81 μg/mL)。河南與貴州產凹葉厚樸提取物與陽性對照PG、BHA、BHT對ABTS自由基的清除能力順序為:PG(IC50=0.74 μg/mL)＞BHA(IC50=2.28 μg/mL)＞乙酸乙酯部位(貴州)(IC50=8.81 μg/mL)＞BHT(IC50=11.94 μg/mL)＞乙酸乙酯部位(河南)(IC50=12.73 μg/mL)＞正丁醇部位(河南)(IC50=15.72 μg/ mL)＞正丁醇部位(貴州)(IC50=29.12 μg/mL)。

圖3顯示，在實驗濃度范圍內，乙酸乙酯提取物(貴州)清除ABTS自由基的能力最強。在質量濃度為25 μg/mL時，清除率已達到100%且清除ABTS自由基的能力與其濃度呈正量效關系 (r= 0.98979);在相同質量濃度下，乙酸乙酯提取物(河南)和PG清除ABTS自由基的能力相近，并且與其濃度呈線性關系 (相關系數分別為 0.99557和0.99854);正丁醇提取物(河南)在質量濃度為25 μg/mL以下時，ABTS自由基清除率隨質量濃度增大幾乎呈線性增加(r=0.9769)，在25 μg/mL以上時，清除率趨于平緩。

圖3 抗氧化劑質量濃度對ABTS自由基的影響Fig.3 Effect of mass concentration of antioxidant on ABTS free radical

2.2.3 FRAP(鐵離子還原能力)法

提取部位與陽性對照PG、BHA、BHT還原Fe3+能力順序為:PG(FRAP值=16330.04 μmolTE/g)＞PHA(FRAP值=8040.13 μmolTE/g)＞BHT (FRAP值=2372.34 μmolTE/g)＞乙酸乙酯提取物(貴州)(FRAP值=952.15 μmolTE/g)＞乙酸乙酯提取物(河南)(FRAP值=856.67 μmolTE/g)＞正丁醇提取物(河南)(FRAP值 =952.15 μmolTE/g)＞正丁醇提取物(貴州)(FRAP值= 356.53 μmolTE/g)＞石油醚提取物(河南)(FRAP值=131.25 μmolTE/g)＞石油醚提取物(貴州) (FRAP值=121.03 μmolTE/g)。表明乙酸乙酯提取物(貴州)還原Fe3+的能力最強(FRAP值=952.15 μmolTE/g);其次為乙酸乙酯提取物(河南) (FRAP值=856.67 μmol TE/g)。

3 結論

首次對凹葉厚樸的α-葡萄糖苷酶抑制活性研究，發現貴州產凹葉厚樸乙酸乙酯提取部位α-葡萄糖苷酶抑制活性最好。就產地而言，貴州產凹葉厚樸乙酸乙酯提取部位和正丁醇提取部位的α-葡萄糖苷酶抑制活性高于河南產凹葉厚樸乙酸乙酯提取部位和正丁醇提取部位。

對凹葉厚樸體外抗氧化活性進行考察，發現貴州產凹葉厚樸乙酸乙酯提取部位還原Fe3+能力最強，河南產凹葉厚樸乙酸乙酯提取部位次之。就產地而言，貴州產凹葉厚樸乙酸乙酯提取部位清除DPPH、ABTS自由基的能力和還原Fe3+能力均好于河南產的;但河南產凹葉厚樸正丁醇提取部位清除DPPH、ABTS自由基的能力和還原Fe3+能力均高于貴州產的。

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