白芍總苷在正常大鼠體內(nèi)的組織分布研究

張玲非，李向軍，王玉峰，劉敏彥，王鑫國(guó)，牛麗穎*

1河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊050091;2石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，石家莊050035

白芍為毛茛科植物芍藥水煮后去外皮的干燥根，性微寒，味苦酸，歸肝脾經(jīng)，具有養(yǎng)血柔肝、緩急止痛、斂陰收汗之功效。白芍總苷(Total glucosides of paeony，TGP)是白芍根中提取的有效部位，具有抗炎、止痛、保肝的作用，還能抑制自身免疫反應(yīng)，對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有良好療效［1］。研究表明，TGP主要含有芍藥苷(Paeoniflorin，Pae)、芍藥內(nèi)酯苷(Albiflorin，Alb)、羥基芍藥苷、苯甲酰芍藥苷等單萜類成分，Pae和Alb含量最高［2］。近年來(lái)對(duì)TGP藥動(dòng)學(xué)參數(shù)研究取得了一定進(jìn)展［2，3］，可是其組織分布特點(diǎn)研究較少。本研究以Pae和Alb為指標(biāo)，研究了單劑量灌胃TGP后正常大鼠體內(nèi)的組織分布情況。

1 材料與方法

1.1 試藥與試劑

芍藥苷對(duì)照品(由四川省維克奇生物科技有限公司提供，純度≥98%);芍藥內(nèi)酯苷對(duì)照品(由四川省維克奇生物科技有限公司提供，純度≥96. 5%);白芍總苷(實(shí)驗(yàn)室自制，其中芍藥內(nèi)酯苷含量15.2%，芍藥苷含量42.6%);乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher試劑公司);水為蒸餾水;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

高效液相色譜儀(Waters 1525 Binary HPLC Pump)，配有紫外檢測(cè)器(Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector)，自動(dòng)進(jìn)樣器(Waters 717 plus Autosampler);冷凍干燥機(jī)(ALPHA1-4);AG135型分析天平(瑞士METTLER-TOLEDO公司);GT16-3高速離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司);MTN-2800D型氮吹儀裝置(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);ZH-2 BLENDER型旋渦儀(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠制造)。

1.3 動(dòng)物

健康Wistar大鼠15只，♂，體重為180±20 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào): 1008155。在恒溫(24±2℃)、光照周期12 h∶12 h環(huán)境中飼養(yǎng)1周后實(shí)驗(yàn)。

1.4 色譜條件

色譜柱為 phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈-0.05%甲酸，肝組織流動(dòng)相比例為15∶85，腎組織比例為14∶86，心、肺、脾、胃、小腸、大腸比例為12∶88;流速1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm;柱溫25℃。結(jié)果顯示在上述條件下，各組織樣品中的Pae、Alb和內(nèi)標(biāo)(IS)峰形良好，理論塔板數(shù)均大于5000(見圖1-8)。

圖1 大鼠心臟凍干粉色譜圖Fig.1 Chromatograms of paeoniflorin and albiflorin in rat heart freeze-dry powder

1.5 組織樣品的預(yù)處理

取各組織樣品(心、肝、脾、肺、腎0.5 g，胃、小腸、大腸0.3 g)，精密稱定，按1∶4(重量/體積比)加入4℃生理鹽水，冰浴勻漿3 min，將勻漿液置5 mL離心管中，于-40℃保存24 h以上，冷凍干燥，稱定各組織凍干粉的重量，計(jì)算各組織每克凍干粉相當(dāng)于組織的重量。

取心臟組織凍干粉0.05 g，加入10 μL龍膽苦苷溶液(IS)(256 μg/mL)，加入600 μL甲醇，渦旋混勻，離心(12000 r/min，10 min)，取上清液，N2下吹干，150 μL甲醇復(fù)溶，10 μL進(jìn)樣分析。

取肝、腎、肺、脾組織凍干粉0.05 g，加入10 μL IS溶液(512 μg/mL)，取胃，小腸，大腸組織凍干粉0.01 g，加入20 μL IS溶液(512 μg/mL)，加入600 μL甲醇，渦旋混勻，離心(12000 rpm，10 min)，取上清液，10 μL進(jìn)樣分析。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取空白心凍干粉，加入適量 Pae和Alb標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成含Pae 7.42、14.84、29.68、59.36、118.72、237.44 μg/g，Alb 4.9、9.8、19.6、39.2、78.4、156.8 μg/g的系列樣品，加入IS溶液，補(bǔ)充甲醇至600 μL，其余按“1.5”項(xiàng)下操作。

取空白肝、腎、肺、脾凍干粉，加入適量Pae和Alb標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成含 Pae 14.84、29.68、59.36、118.72、296.8、593.6、1187.2 μg/g，Alb 9.8、19.6、39.2、78.4、196、392、784 μg/g的系列樣品，加入IS溶液，補(bǔ)充甲醇至600 μL，其余按“1.5”項(xiàng)下操作。

取空白胃、小腸、大腸凍干粉，加入適量 Pae和Alb標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成含Pae 728.75、1457.5、2915、7287.5、14575 μg/g，Alb 222、444、888、2220、4440 μg/g的系列樣品，加入IS溶液，補(bǔ)充甲醇至600 μL，其余按“1.5”項(xiàng)下操作;建立Pae和Alb的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

測(cè)得各組織中Pae和Alb的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見表1)，最低定量濃度分別為標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)(S/N＞10)。

表1 各組織凍干粉中Pae和Alb的回歸方程與線性范圍Table 1 Regression equation and linear rang in tissue freeze-dry powder

1.7 日內(nèi)精密度與準(zhǔn)確度

根據(jù)“1.6”項(xiàng)下方法，以空白組織凍干粉配制低、中、高(心 Pae 14.84、59.36、237.44 μg/g，Alb 9.8、39.2、156.8 μg/g;肝、腎、肺、脾 Pae 29.68、118.72、593.6 μg/g，Alb 19.6、78.4、392 μg/g;胃、小腸、大腸 Pae 728.75、2915、14575 μg/g，Alb 222、 888、4440 μg/g)3個(gè)不同濃度的組織樣品，記錄峰面積比值，根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線求得日內(nèi)精密度與準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示低、中、高3個(gè)濃度各組織Pae和Alb的日內(nèi)精密度RSD%均在10%以內(nèi)，準(zhǔn)確度均在(100±10)%以內(nèi)，符合生物樣品分析方法的要求。

1.8 日間精密度

以空白組織凍干粉配制低、中、高3個(gè)不同濃度的組織樣品，每一濃度1個(gè)樣本，連續(xù)3天，記錄峰面積比值，根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線求得日間精密度。結(jié)果顯示低、中、高3個(gè)濃度各組織Pae和Alb的日間精密度RSD%均在10%以內(nèi)。

1.9 提取回收率

以空白組織凍干粉配制低、中、高3個(gè)不同濃度的組織樣品，每一濃度進(jìn)行5樣本分析，計(jì)算待測(cè)峰與內(nèi)標(biāo)峰面積之比，記為a;取空白組織凍干粉按“1.5”項(xiàng)下方法操作，提取上清液，取低、中、高3個(gè)不同濃度的Pae、Alb標(biāo)準(zhǔn)溶液，N2下吹干，加入提取的上清液，渦旋混勻，進(jìn)樣，計(jì)算待測(cè)峰與內(nèi)標(biāo)峰面積之比，記為b，a/b即為提取回收率。內(nèi)標(biāo)溶液經(jīng)同法處理。結(jié)果低、中、高3個(gè)濃度各組織的回收率分別為 Pae 68.75%-76.30%(n=5)，Alb 69.82%～76.62%(n=5)，IS經(jīng)同法提取處理，其回收率為71.98%～80.23%(n=5)，RSD%均在10%以內(nèi)。

1.10 穩(wěn)定性

考察了組織樣品預(yù)處理后室溫放置4、8、12、24 h后的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示樣品預(yù)處理后室溫放置測(cè)得的RSD%均在10%以內(nèi)，表明Pae和Alb在預(yù)處理后的溶液中穩(wěn)定。

1.11 樣品的采集

按體重將大鼠隨機(jī)分為3組，每組5只，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水，按2.82 g/kg體重灌胃給予TGP水溶液(10 mL/kg)，分別于1 h、3 h、6 h以10%水合氯醛麻醉大鼠，立即取出心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、大腸等組織(其中小腸自胃下取10 cm左右，大腸自盲腸下取10 cm左右)，用生理鹽水沖凈組織表面血跡及內(nèi)容物，拭干，裝入自封袋中，-20℃保存，備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果

各組織重量與凍干粉重量比值:心 5.61、肝3.37、脾 4.37、肺 5.68、腎 3.81、胃 4.56、小腸4.09、大腸5.21。

測(cè)得各組織凍干粉中Pae和Alb濃度，根據(jù)各組織凍干粉中Pae和Alb濃度及組織重量與凍干粉重量比值計(jì)算各組織中兩者濃度，結(jié)果見表2、圖9，各時(shí)間點(diǎn)各組織中兩者濃度大小如下:

1 h Pae濃度順序?yàn)?小腸＞胃＞大腸＞腎＞肝＞肺＞脾＞心

Alb:小腸＞胃＞大腸＞肝＞腎＞肺＞脾＞心

3 h Pae濃度順序?yàn)?小腸＞胃＞大腸＞腎＞脾＞肝＞肺＞心

Alb:小腸＞胃＞大腸＞腎＞脾＞肝＞肺＞心

6 h Pae濃度順序?yàn)?小腸＞大腸＞胃＞腎＞肝＞脾＞肺＞心

Alb:小腸＞大腸＞胃＞腎＞肝＞肺＞脾＞心

表2 大鼠灌胃給予2.82 g/kg TGP后各組織中Pae和Alb的分布(±s，n=5)Table 2 Distribution of albiflorin and paeoniflorin in tissues after an oral administration of 2.82g/kg TGP in rats(±s，n=5)

表2 大鼠灌胃給予2.82 g/kg TGP后各組織中Pae和Alb的分布(±s，n=5)Table 2 Distribution of albiflorin and paeoniflorin in tissues after an oral administration of 2.82g/kg TGP in rats(±s，n=5)

濃度Concentration(μg/g)芍藥內(nèi)酯苷Albiflorin 芍藥苷Paeoniflorin 1±0.83 17.39±5.43 1.52±0.08肝Liver 36.02±11.08 38.13±7.50 6.83±1.75 57.86±11.51 100.06±28.44 10.18±2.65脾Spleen 6.27±1.76 46.60±11.08 3.33±0.70 13.55±4.68 124.78±33.66 9.82±3.52肺Lung 25.40±4.83 28.18±8.97 4.40±1.68 54.31±12.23 90.71±21.26 4.90±0.87腎Kidney 35.14±10.49 57.28±10.56 10.97±4.18 88.24±23.21 134.76±26.13 29.80±7.62胃Stomach 574.77±140.97 400.12±130.17 57.23±8.90 1332.97±259.72 977.22±271.46 166.66±6.43小腸Small intestine645.70±118.55 414.41±81.38 359.15±101.16 1651.99±290.93 1096.84±392.33 922.98±273.53大腸Large intestine169.48±21.23 342.34±75.30 252.94±75.92 436.39±155.54 902.08±145.31 6 1 h 3 h 6 h 1 h 3 h 6 h心Heart 1.14±0.30 6.95±2.71 1.09±0.18 3.1 14.09±202.18

圖9 大鼠灌胃給予2.82 g/kg TGP后各組織中Pae和Alb的分布(n=5)Fig.9 Distribution of paeoniflorin and albiflorin in tissues after an oral administration of 2.82 g/kg TGP in rats(n=5)

2.2 討論

藥物進(jìn)入血液后，隨血液分布到機(jī)體各組織中，了解藥物的組織分布特點(diǎn)，有助于了解藥物作用的靶器官，預(yù)測(cè)藥物的藥理作用，對(duì)擴(kuò)大藥物的臨床用途有著重要意義;組織分布研究還提供了藥物的蓄積部位和程度，對(duì)于預(yù)測(cè)藥物不良反應(yīng)和毒副作用有重要的指導(dǎo)意義;研究中藥的組織分布還可以給中藥歸經(jīng)理論提供一定的現(xiàn)代理論支持，白芍歸肝脾經(jīng)，可是對(duì)其現(xiàn)代研究較少，研究TGP的組織分布特點(diǎn)有助于進(jìn)一步闡明白芍歸經(jīng)的實(shí)質(zhì)［4，5］。

組織中藥物含量常常因?yàn)樘停^難測(cè)出，本實(shí)驗(yàn)在本課題TGP藥動(dòng)學(xué)參數(shù)研究的基礎(chǔ)上，并經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，以高效液相色譜法為研究手段，選擇230 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，乙腈-0.05%甲酸作為流動(dòng)相，龍膽苦苷為內(nèi)標(biāo)，調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例，來(lái)滿足各組織凍干粉中樣品的測(cè)定。樣品預(yù)處理方面本實(shí)驗(yàn)采用生理鹽水將組織勻漿后，嘗試了以高氯酸沉蛋白及乙酸乙酯萃取等法進(jìn)行提取，結(jié)果由于含量太低，不易測(cè)出;后嘗試將定量的組織勻漿液冷凍干燥處理，稱取一定量的凍干粉作為預(yù)處理樣品，將凍干粉進(jìn)行乙酸乙酯提取、甲醇提取、高氯酸沉蛋白等法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇提取率最高，此法相當(dāng)于濃縮過(guò)程，克服了含量太低難測(cè)出的缺陷。

本實(shí)驗(yàn)研究了灌胃TGP后1、3、6 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的組織分布情況，分別代表組織分布的吸收分布相、平衡相、消除相。1 h各組織中均能檢測(cè)到Pae和Alb，說(shuō)明TGP分布較迅速而且廣泛，這與本課題研究TGP血漿結(jié)合蛋白率低相吻合，正是由于其血漿蛋白結(jié)合率低，所以游離型藥物濃度較高而能迅速轉(zhuǎn)移到組織;小腸壁、胃壁、大腸壁中Pae和Alb濃度最高，可能是因?yàn)樾∧c為主要吸收器官，其次是腎肝及肺等組織，可能是因?yàn)檫@些組織血流量較大，心脾中濃度較小，可能由于兩者與心脾親和力較小。3 h除胃和小腸外，其他各組織中兩者含量都達(dá)到高峰;胃壁及腸壁濃度最高，為文獻(xiàn)報(bào)道TGP對(duì)三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎具有保護(hù)作用［6］及白芍具有瀉下作用［7］提供了藥動(dòng)學(xué)上的支持，其次是腎、脾、肝，為文獻(xiàn)報(bào)道TGP對(duì)糖尿病大鼠早期腎損害［8，9］及肝損傷［10，11］大鼠具有保護(hù)作用提供了依據(jù)，說(shuō)明TGP組織分布情況與其藥效密切相關(guān);胃、肝、脾中濃度較高可能與傳統(tǒng)中醫(yī)理論中白芍養(yǎng)血柔肝、緩急止痛，治療胸脅脘腹疼痛的作用有關(guān)，為進(jìn)一步研究白芍的藥理作用及作用機(jī)理提供了指導(dǎo);白芍歸肝脾經(jīng)，TGP主要分布于胃腸及腎脾肝，與其歸經(jīng)部位有些差異，但也為白芍的歸經(jīng)理論及相關(guān)研究提供了一定的現(xiàn)代科學(xué)依據(jù);6 h小腸壁、大腸壁及胃壁中濃度較高，說(shuō)明口服TGP后容易在胃腸道蓄積，印證了TGP治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎時(shí)有輕微的胃腸不良反應(yīng)，如腹瀉、便稀等［1，12］，其次是腎中濃度較高，推斷腎可能是原型TGP的主要排泄器官，其他各組織中兩者濃度都較小，說(shuō)明TGP口服后在肝、脾、肺、心等組織中蓄積較少，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)各組織中Pae比Alb濃度下降稍快，可能組織中Pae比Alb代謝稍快，具體機(jī)制還需進(jìn)步研究。

本研究考察了TGP在正常大鼠體內(nèi)的組織分布情況，發(fā)現(xiàn)灌胃TGP后組織分布迅速且廣泛，胃、小腸、大腸及腎、脾、肝是主要分布器官，TGP容易在胃腸蓄積，其他組織中蓄積較少，其組織分布特點(diǎn)與其現(xiàn)代藥理作用、不良反應(yīng)及歸經(jīng)理論有一定的關(guān)聯(lián)，為進(jìn)一步研究白芍總苷的藥理作用及作用機(jī)理提供了指導(dǎo)，同時(shí)也為白芍的歸經(jīng)理論提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

1 Min WQ(閔偉琪)，Wei Q(魏琴)，Li HY(李洪毓)，et al.A clinical study of total glucosides paeony in the treatment of rheumatoid arthritis.Chin J Rheumatol(中華風(fēng)濕病學(xué)雜志)，2005，9:487-491.

2 Wang Q(王巧).Study on the method of quality control of paeony root and pharmacokinetic of total glucoside of paeony.Shenyang:Shenyang Pharmaceutical University(沈陽(yáng)藥科大學(xué))，PhD.2005.

3 Liu B(劉斌).Study on pharmacokinetics of multi-dose of paeoniflorin in normal rats.Anhui:Anhui Medical University (安徽醫(yī)科大學(xué))，Master.2009.

4 Liu P(劉萍)，Wang P(王平)，Chen G(陳剛)，et al.Study and thinking on channel entry theory of the traditional Chinese medicine.Liaoning J Tradit Chin Med(遼寧中醫(yī)雜志)，2010，37:2339-2341.

5 Lu GW(陸光偉).Channel Entry of the Traditional Chinese medicine and Distribution of the components in body.Chin Tradit Patent Med(中成藥研究)，1984，20:38-39.

6 Zhou J(周進(jìn))，Wu ZX(吳正祥)，Yang JH(楊九華)，et al.Effect of total glucosides of paeony on TNBS-induced Experimental Colitis in Rats.Chin J Gastroenterol(胃腸病學(xué))，2009，14:154-158.

7 Qin JJ(覃俊佳)，Qin P(覃平)，Luo YD(羅宇東)，et al.Experimental study on the mechanism of purgation effect of paeony.Chin J Tradit Med Sci Technol(中國(guó)中醫(yī)藥科技)，1998，5:155-157.

8 Fang F(方芳).Effects of total glucosides of paeony on oxidative stress in the kidney of diabetic rats.Anhui:Anhui Medical University(安徽醫(yī)科大學(xué))，Master.2008.

9 Su J(蘇靜)，Wu YG(吳永貴)，Zhang JJ(張晶晶)，et al.Effect of total glucosides of paeony on activation of JAK/ STAT pathway in the kidney from diabetic rat.Chin J Mod Med(中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志)，2009，19:362-366.

10 Li RL(李瑞麟)，Ma Y(馬勇)，Wei W(魏偉)，et al.Pharmacological effects of total glucosides from paeony root on CCl4-induced liver fibrosis and function of hepatic stellate cells.Chin J New Drugs(中國(guó)新藥雜志)，16:685-689.

11 Cui W(崔巍).The beneficial effect of TGP in hepatic ischemia and reperfusion injury in rats.Anhui:Anhui Medical U-niversity(安徽醫(yī)科大學(xué))，Master.2006.

12 Li ZJ(李志軍)，Liu Y(劉雁)，Mei YJ(梅永君)，et al.E-valuate the efficacy of TGP(白芍總苷)in the treatment of ankylosing spondylitis and investigate the mechanism of the efficacy.Pharm Clin Chin Mater Med(中藥藥理與臨床)，2009，25:68-70.