葡萄植株中白藜蘆醇及葡萄素含量動態積累規律研究

謝紅旗，劉發寶，楊星星，劉 薇，曾建國

1湖南農業大學園藝園林學院，長沙410128;2湖南中藥提取工程技術研究中心，長沙410331; 3湖南中醫藥大學，長沙410007;4湖南省作物種質創新與資源利用重點實驗室，長沙410128

葡萄是葡萄屬(Vitis)落葉藤本植物，葡萄在世界果樹生產中占據重要地位，其栽培面積和產量曾長期位居世界水果生產首位［1］。葡萄不僅營養豐富而且具有醫療保健功效，中國古代醫書就有記載其根、藤、葉可入藥。隨著現代醫學的發展，對葡萄的研究更加深入透徹，國內外學者發現葡萄中的芪類化合物具有很好的生物活性，可作為保健品和新藥開發的原材料。芪類化合物(stilbenoids)是指具有1，2-二苯乙烯為骨架的化合物及其聚合物的總稱，包括二苯乙烯(stilbene)、二苯乙基(bibenzyl)、菲類(phenanthrene)及它們的衍生物［2］。目前，研究較多的芪化物是白藜蘆醇和葡萄素，葡萄素為白藜蘆醇的二聚體。白藜蘆醇具有很強的抗氧化功能和抑制心血管疾病與抗癌作用，已廣泛地應用于醫藥、保健品、化妝品和食品添加劑等領域。芪類化合物主要分布在植物的木質部薄壁組織內，是植物受到病蟲害或其他不利刺激時產生的應激產物［3］。研究發現，在葡萄屬植物的根、莖、葉、果實、種子及葡萄酒中均能檢測到芪化物的存在，但是由于品種、生長環境、檢測部位的不同，芪化物的含量和種類也不同。王琴飛等利用高效液相色譜分析方法在葡萄葉片中同時檢測到5種芪化物，它們分別為:白藜蘆醇、云杉苷、ε-葡萄素、δ-葡萄素、紫檀芪［4］。Creasy等和Roggero等的研究都表明葡萄皮中存在有白藜蘆醇及其低聚物［5，6］，Sun等報道在葡萄籽中發現有白藜蘆醇及其低聚物［7］，Bavaresco等發現葡萄藤中也存在簡單芪類化合物存在［8］。李婷等對不同品種的葡萄種籽、果皮、果梗、葉片、葉柄中的白藜蘆醇含量進行了測定與比較［9］，結果表明不同品種葡萄、不同部位白藜蘆醇含量有較大差異。但未見文獻對葡萄植株中不同部位在其生長周期內其主要活性成分白藜蘆醇與葡萄素的動態積累規律進行調查。

本實驗在對湖南境內主要葡萄品種芪類化合物資源調查的基礎上，選擇芪類化合物含量相對較高的紅地球品種為考察對象，在其一年的生長周期內測定主要芪化物白藜蘆醇與葡萄素在葡萄植株各部位的含量動態變化規律，以期為合理利用葡萄植株中芪類化合物提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料及采樣部位

葡萄材料來源于湖南瀏陽永安鎮葡萄園，品種為紅地球葡萄品種，對葡萄植株不同部位在不同生長期的兩種芪化物含量變化進行考察，采樣部位于圖1所示。白藜蘆醇標準樣品(Sigma公司)，ε-葡萄素對照樣品(實驗室自制，含量大于98%)，乙酸(分析純);甲醇(色譜純)。

圖1 采樣部位示意圖Fig.1 The diagram of sampling position

1.2 采樣方法

1.2.1 根、藤的采樣方法

采樣周期:2010年4月至2011年1月，每月采集一次。對整個植株進行采收，每次一株，對根和各部位的藤(如圖1所示)分開處理。

1.2.2 葉、藤的采樣方法

2010年4月至2011年1月，每月兩次，月初和月中各一次，采樣方法:固定選取紅地球品種一株，每次采集葉、圖1所示的3號藤、4號藤適量，三個部位分開處理，制備供試品。

1.3 樣品制備方法

將采集到的葡萄鮮材不同部位分開處理，粉碎混勻。稱取粉碎的樣品5 g，置于250 mL具口三角瓶內，加甲醇100 mL，稱重，常溫超聲輔助提取1 h，放冷至室溫，再稱重并補重，混勻，減壓過濾，得濾液，將提取液過0.45 μm濾膜，即得供試品溶液。

1.4 白藜蘆醇與葡萄素分析方法

采用高效液相色譜法測定白藜蘆醇與葡萄素含量，色譜條件如下:waters1525高效液相色譜系統，色譜柱:Hypersil，ODS C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);2998PAD檢測器，檢測波長306nm;流速:0.8 mL/min;柱溫:35℃;進樣量:10 μL;二元梯度洗脫，流動相:(A)水-(B)乙腈，梯度洗脫方案如表1所示。

表1 高效液相色譜分析梯度洗脫方案Table 1 The scheme of gradient elution of HPLC analysis

1.5 白藜蘆醇及葡萄素標準溶液的配制

準確稱取一定量的反式白藜蘆醇標準樣品和ε-葡萄素對照品，分別置于10 mL容量瓶中，加少量甲醇超聲溶解，冷卻后用甲醇定容至刻度，配成白藜蘆醇0.1066 mg/mL、ε-葡萄素0.5123 mg/mL的貯備液，取一定量貯備液加甲醇稀釋得0.213～106.6 μg/mL的白藜蘆醇和1.025～512.3 μg/mL的ε-葡萄素標準溶液，置于4℃的冰箱中避光保存備用。

2 結果與分析

2.1 白藜蘆醇與葡萄素工作曲線

在上述色譜條件下測定，以色譜峰面積對質量濃度作圖，得工作曲線，白藜蘆醇的線性回歸方程為Y=43954 X－3402.8，相關系數R=0.9999;ε-葡萄素的線性回歸方程為Y=17888 X－5957，相關系數R=0.9999。其中Y為峰面積，X為白藜蘆醇或ε-葡萄素標準品質量濃度。標準品與樣品色譜峰如圖2～4所示。

2.2 葡萄紅地球根中白藜蘆醇與葡萄素含量動態變化

從2010年4月至2011年1月，每月的10號隨機采集葡萄園中1株植株，按照樣品處理方法制備供試液，分析其中白藜蘆醇與葡萄素的含量，實驗結果如圖5所示，從圖5可以看出，葡萄根中含有一定量的白藜蘆醇和葡萄素，其中葡萄素的含量是白藜蘆醇的含量3倍左右，且白藜蘆醇與葡萄素含量在不同生長時期有著明顯的變化，特別是葡萄素含量差異明顯，從4月份到9月份，葡萄素的含量一直處于上升趨勢，從9月份到次年1月份逐漸下降。白藜蘆醇也具有相似的規律，但白藜蘆醇含量在11月份達到峰值。

2.3 葡萄紅地球主藤中白藜蘆醇與葡萄素含量動態變化

實驗考查了從2010年4月到2011年1月葡萄紅地球主藤中白藜蘆醇與葡萄素含量隨時間變化規律，實驗結果如圖6所示，結果表明主藤中白藜蘆醇含量較根中低些，而葡萄素含量主藤則比根中高許多，到10月份，葡萄素含量達到1700 ppm以上，葡萄素含量是白藜蘆醇含量10倍左右。白藜蘆醇與葡萄素含量隨時間變化規律相似，白藜蘆醇到11月份達到最高，而葡萄素含量在10月份達到最高。

2.4 葡萄紅地球側藤中白藜蘆醇與葡萄素含量動態變化

圖9 葡萄葉中白藜蘆醇與葡萄素含量動態變化圖Fig.9 The trendline of dynamic accumulation of the resveratrol and viniferin content in grape leaves

實驗考查了側藤中白藜蘆醇與葡萄素含量一年生長期內隨時間的變化規律，實驗結果如圖7所示，實驗結果表明，側藤中含有白藜蘆醇和葡萄素，葡萄素含量隨季節的變化影響較大，10月份含量最高，達到1600 ppm以上，白藜蘆醇在9月份含量最高，約為130 ppm左右，與主藤相似，葡萄素的含量也是白藜蘆醇含量的10倍左右。

圖10 葡萄葉柄白藜蘆醇與葡萄素含量動態變化圖Fig.10 The trendline of dynamic accumulation of the resveratrol and viniferin content in grape leafstalk

2.5 葡萄紅地球支藤中白藜蘆醇與葡萄素含量動態變化

實驗考查了支藤中白藜蘆醇與葡萄素含量一年生長期內隨時間的變化規律，實驗結果如圖8所示，實驗結果表明，支藤中白藜蘆醇含量相對根、主藤、側藤較低，只有50%左右，而葡萄素含量較高，葡萄素含量隨季節的變化影響明顯，10月份含量最高，達到1300 ppm以上，而在4月份僅180 ppm。白藜蘆醇與葡萄素隨時間變化規律相似，都是從4月份到10月份一直呈上升趨勢，從10月到次年1月份，逐漸降低。

2.6 葡萄紅地球葉片及葉柄中白藜蘆醇與葡萄素含量動態變化

實驗考查了葉片和葉柄中白藜蘆醇與葡萄素含量及隨時間積累規律，實驗結果如圖9及圖10所示，實驗結果表明，葉片和葉柄中均含有白藜蘆醇和葡萄素，兩者葡萄素和白藜蘆醇的含量沒有明顯區別，和藤等其他部位相比，葡萄素含量很低，僅為十分之一左右。白藜蘆醇與葡萄素在葉中的積累規律相似，與其他部位的積累規律也相似，基本上都是從4月份到10月份呈上升趨勢，到10月份含量達到最高峰，然后從10月到次年1月份，逐漸降低。

3 討論

從試驗結果與分析我們可以得到以下結論: 3.1 葡萄植株中的白藜蘆醇和葡萄素動態含量變化范圍較大，且不同部位之間含量有較大差異?？傮w來說不同部位白藜蘆醇和葡萄素的含量情況是:主藤＞側藤＞支藤＞根＞葉片≈葉柄。

3.2 葡萄藤中白藜蘆醇和葡萄素在生長周期內含量變化趨勢是先升后降，在9月份，白藜蘆醇含量達到最高，而葡萄素含量在10月份達到最高，往后呈下降趨勢，故選擇9月中旬至10月初采收藤較適宜。此外，藤適合于作為生產白藜蘆醇和葡萄素的提取原料。

3.3 葡萄葉和葉柄中白藜蘆醇和葡萄素含量相差不大，在生長期含量變化趨勢是先升后降，在9月份，白藜蘆醇含量達到最高，而葡萄素含量在10月份達到最高，往后呈下降趨勢。兼顧到9月葉正處于茂盛時期，生物總量較高，故選擇9月采收葉較適宜。

3.4 葡萄根中白藜蘆醇和葡萄素在生長期含量變化趨勢也是先升后降，但在11月份，白藜蘆醇含量達到最高，而葡萄素含量在9月份達到最高，這與藤和葉有較大差異。雖然根中白藜蘆醇和葡萄素含量高于葉，但葡萄的根是不能采收的部位，故可開展根部細胞的細胞培養替代技術以保護植物資源。

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2 Peng SX(彭司勛)，Zhao SX(趙守訓)，Liao QJ(廖清江)，et al.Medicine Chemistry Progress II(藥物化學進展2).Beijing(北京):Chemical industry publishing house(化學工業出版社)，2002，12:134-157.

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4 Wang QF(王琴飛)，Ma LY(馬麗艷)，Huang MJ(黃綿佳)，et al.Determination of five stilbenes composition in grape leaves by high performance liquid chromatography.Chin J Anal Chem(分析化學)，2008，10:1359-1363.

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8 Bavaresco L，Cante E，Fregoni M，et al.Constitutive stilbene contents of grapevine cluster stems as potential source of resveratrol in wine.Vitis，1997，36:115-118.

9 Li T(李婷)，Li S(李勝)，Zhang QS(張青松)，et al.Comparison of the resveratrol contents in different grape tissues.J Gansu Agric Univ(甘肅農業大學學報)，2009，44(2):64-67.