基于響應面法從連翹葉中提取連翹酯苷A和連翹苷的工藝優化

劉偉霞，楊建雄

1陜西師范大學物理學與信息技術學院;2陜西師范大學生命科學學院，西安710062

連翹葉是木犀科植物連翹 Forsythia suspense (Thunb.)Vahl的干燥葉，具有清熱解毒、抗菌、保肝、降血脂、抗氧化及抗衰老等作用［1-5］，主要含有連翹苷、連翹酯苷、蘆丁、齊墩果酸、熊果酸、右旋松脂酚等化學成分［6］。其中連翹苷具有抗氧化和降血脂的作用，對于預防動脈粥樣硬化和冠心病等疾病有一定功效［7］;連翹酯苷具有抑制彈性蛋白酶活性，治療肺氣腫等多種疾病的功效［8］，是迄今為止從連翹屬植物中發現的抗菌活性最強的成分之一。近年來的研究發現連翹葉中的連翹苷、連翹酯苷A的含量高于果實［3］，且2010版中國藥典規定連翹苷和連翹酯苷A的含量為連翹藥材的質控指標［9］。我國的連翹葉資源豐富，價格低廉，有效提取其生物活性物質，可提高連翹葉的經濟附加值。為開發和利用豐富的連翹葉資源，研究人員已分別開展了連翹苷和連翹酯苷A提取的工藝研究工作［10-12］。但是，從連翹葉中復合提取這兩種活性物質的工藝研究尚未見報道。

響應面分析法是一種優化工藝條件的有效方法［13］，與傳統的正交實驗相比，響應面分析法具有試驗周期短，效率高，能在整個實驗設計的區域上給出因素與響應值之間的回歸方程、因素的最佳組合和響應值的最優值。本文利用響應面法優化從連翹葉中同時提取連翹酯苷A和連翹苷的工藝條件，以期為連翹葉的進一步開發利用提供實驗數據。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Shimadzu HPLC-20A vp型高效液相色譜儀系統(日本島津)，Sartorius BP221S電子天平，KQ-300DE型數控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，TU-1810紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)，數顯電熱恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)，旋轉蒸發器RE-52AA(上海亞榮生化儀器廠)，Milli-QG超純水制備儀(美國Millipore公司)。

1.2 試劑

連翹葉2011年5月采自陜西師范大學校園內，由生命科學學院植物學教研室田先華教授鑒定。連翹酯苷A(批號:A0590～20 mg)和連翹苷(批號: A0272～20 mg)對照品均購自成都曼斯特公司，含量均在98%以上。甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 含量測定方法的建立

色譜條件:大連依利特色譜柱Hypersil BDS C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為甲醇(A)-水(含0.2%冰醋酸)(B)，梯度洗脫:0～7 min，28%～38%A;7～11 min，38%～40%A;11～25 min，40%～60%A;25～30 min，60%A，測定波長235 nm，流速l mL/min，柱溫30℃，進樣量10 μL。此條件下對照品及及樣品的色譜圖見圖1。色譜峰的理論板數按連翹酯苷峰計算在5000以上。

對照品溶液的制備:精密稱取連翹酯苷A對照品和連翹苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含連翹酯苷A 0.576 mg和連翹苷0.270 mg的混合溶液。

樣品溶液的制備:稱取連翹葉粉末1 g，置三角瓶中，于不同條件下浸泡提取，放冷，抽濾，取樣液1 mL，旋轉蒸發儀50℃蒸干，加入50%甲醇10 mL，超聲溶解，再經0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液待用。

標準曲線:精密吸取上述對照品溶液1、2、4、6、8、10、12 μL分別進樣測定，以峰面積Y為縱坐標，進樣量X為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為:

連翹酯苷A:Y=812084X－12006，R2=0.9999。表明連翹酯苷A濃度在0.576～6.912 μg內線性關系良好。

連翹苷:Y=840808X+8539.7，R2=0.9999。表明連翹苷濃度在0.27～3.24 μg內線性關系良好。

精密度試驗:取同一混合對照品溶液重復進樣5次，記錄峰面積，計算連翹酯苷 A的 RSD為0.30%(n=5)，連翹苷的RSD為0.54%(n=5)，說明該方法精密度良好。

穩定性試驗:取同一混合對照品溶液在10 h之內每間隔2 h測定一次，記錄峰面積，計算得連翹酯苷A的RSD為1.48%(n=6)，連翹苷的RSD為0.44%(n=6)，說明對照品溶液在10 h內穩定。

重復性試驗:在相同條件下，將同一批樣品制成5份樣品溶液，分別測定含量，計算得連翹酯苷A的RSD為1.20%，連翹苷的RSD為0.80%(n=5)，說明該方法重復性好。

圖1 樣品(a)及混合對照品(b)的色譜圖Fig.1 Chromatogram of sample(a)and mixture standards(b) 1.Forsythiaside;2.Phillyrin

2.2 單因素試驗對連翹酯苷A和連翹苷的提取率影響

五月份采摘連翹葉［14］，于鼓風干燥箱干燥24 h后粉碎，按照上述含量測定項測定濾液中連翹酯苷A和連翹苷的含量，計算提取率。

提取率=提取所得目標物質的量/連翹葉的干重× 100%

2.2.1 乙醇濃度

固定提取時間為60 min，浸提溫度60℃，液料比為25∶1，考察乙醇濃度(10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%)對連翹酯苷A和連翹苷得率的影響，連翹酯苷A的提取率分別為3.47%、4.63%、5.16%、5.76%、6.18%、6.19%、6.21%，連翹苷的提取率分別為1.27%、1.87%、2.07%、2.51%、2.71%、2.81%、2.96%。當乙醇濃度大于50%，連翹酯苷A的提取率變化不大，連翹苷的提取率提高幅度較小，并且隨著乙醇濃度的提高，雜質溶出率也增多，故綜合考慮，本試驗選擇50%乙醇為提取溶劑。

2.2.2 浸提溫度

采用50%乙醇為提取溶劑，液料比為25∶1提取60 min，考察浸提溫度(40，50，60，70，80，90℃)對連翹酯苷A和連翹苷提取率的影響。隨著溫度的升高，連翹酯苷A的提取率先增后減，分別為5.94%、6.67%、7.28%、8.00%、7.95%、7.27%，連翹苷的提取率逐漸增加，分別為2.21%、2.58%、2.77%、2.89%、2.90%、2.97%。可能的原因是連翹酯苷A分子中具有酯鍵，較高溫度下易水解，從而影響提取率。另外，溫度越高雜質溶出量也越多，故綜合考慮連翹酯苷A的穩定性以及能源節約，選取70℃為提取溫度。

2.2.3 液料比

采用50%乙醇為提取溶劑，70℃浸提60 min，考察液料比(10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1)對連翹酯苷A和連翹苷提取率的影響，連翹酯苷A的提取率分別為4.88%、6.11%、6.61%、7.43%、7.36%，連翹苷的提取率分別為2.00%、2.39%、2.66%、2.98%、3.09%。可見，液料比為25∶1時，連翹酯苷A和連翹苷的提取率均達到較高，故液料比選用25∶1。

2.2.4 浸提時間

采用50%乙醇為提取溶劑，浸提溫度70℃，液料比為25∶1，考察浸提時間(30，60，90，120，150 min)對連翹酯苷A和連翹苷提取率的影響，連翹酯苷A的提取率分別為7.42%、7.76%、7，78%、7.81%、7.65%，連翹苷的提取率分別為2.73%、2.88%、2.90%、2.93%、2.92%。浸提時間超過60 min則連翹酯苷A和連翹苷的提取率均增減很少。150 min時連翹酯苷A還略有降低，可能是連翹酯苷A不穩定，因水解而降低了提取率，故浸提時間選擇60 min。

2.3 響應面分析法優化工藝條件［15］

2.3.1 響應面模型建立

根據Box-Behnken的中心組合實驗設計原理［16］，綜合單因素試驗考察結果，采用 Design-Expert 8.0.5b軟件為輔助手段設計四因素三水平的響應面分析試驗，試驗因素和水平見表1。

表1 Box-Behnken中心組合設計因素及水平表Table 1 Factors and levels of BBD combination experiment

對A(液料比)、B(乙醇濃度)、C(浸提時間)、D (浸提溫度)四個因素做以下變換:X1=(A－25)/ 5，X2=(B－50)/10，X3=(C－60)/30，X4=(D－70)/10，以X1、X2、X3、X4為自變量，以連翹酯苷A提取率(Y1)和連翹苷提取率(Y2)為響應值，采用Design-Expert 8.0.5b進行統計分析。

2.3.2 響應面結果

共設計29個試驗點，1～24號為析因實驗，25～29號為中心試驗。試驗設計和試驗結果見表2。利用Design-Expert 8.0.5b軟件對表2實驗數據進行回歸擬合，得到以連翹酯苷A提取率(Y1)和連翹苷提取率(Y2)為響應值的二次多項回歸方程為:

表2 Box-Behnken設計方案及試驗結果Table 2 Box-Behnken Design matrix and experimental results of forsythiaside yield and phillyrin yields from F.suspense leaves

6.7 8 2.8 7 9 -1 0 0 -1 6.0 5 2.5 1 1 0 1 0 0 -1 6.6 6 2.6 7 1 1 -1 0 0 1 6.5 5 2.7 4 1 2 1 0 0 1 7.3 5 3.0 0 1 3 0 -1 -1 0 6.3 5 2.5 7 1 4 0 1 -1 0 6.8 0 2.9 8 1 5 0 -1 1 0 6.4 9 2.5 9 1 6 0 1 1 0 6.8 6 3.0 4 1 7 -1 0 -1 0 6.3 2 2.5 6 1 8 1 0 -1 0 7.2 1 2.9 1 1 9 -1 0 1 0 6.4 8 2.7 2 2 0 1 0 1 0 7.0 8 2.8 2 2 1 0 -1 0 -1 5.9 4 2.2 2 2 2 0 1 0 -1 6.2 4 2.7 1 2 3 0 -1 0 1 6.4 3 2.5 4 2 4 0 1 0 1 6.8 8 2.8 9 2 5 0 0 0 0 7.2 9 2.9 0 2 6 0 0 0 0 7.2 2 2.9 2 2 7 0 0 0 0 7.2 0 2.8 1 2 8 0 0 0 0 7.2 5 2.8 6 8 0 0 1 1 2 9 0 0 0 0 7.2 8 2.8 8

2.3.3 回歸模型方差分析

二次多項回歸模型方程擬合可靠性由 R2表達，其統計學上的顯著性由F值檢驗，影響因素的線性效應、平方效應及其交互效應的顯著性由模型系數的P值檢驗。分別對連翹酯苷A提取率和連翹苷提取率的回歸模型及各參數的顯著度進行驗證，結果見表3a和表3b。

表3 a 連翹酯苷A回歸模型方差分析Table 3 a Analysis of variance for Forsythiaside regression model

注:＊＊P＜0.001，*P＜0.05。下同。Note:＊＊P＜0.001;*P＜0.05.The same below.

由表3a可知，該模型的P＜0.0001，說明模型回歸高度顯著。回歸方程的相關系數(R2)為0.9900，說明模型響應值的變化99.00%來自所選考察變量，因此，回歸方程可以較好地描述考察因子與響應值之間的關系。其中液料比、乙醇濃度、浸提溫度對連翹酯苷A提取率的影響最大，浸提時間對連翹酯苷A提取率的影響最小。模型的一次項X1， X2，X4極顯著，X3不顯著;二次項均極顯著;交互項X1X2極顯著，X1X3顯著，其余不顯著，這表明各影響因素對于連翹酯苷A提取率的影響不是簡單的線性關系。失擬度的P值為0.1337＞0.05，對連翹酯苷A提取率影響不顯著，說明該模型的擬合度較好。可以利用該模型確定最佳工藝條件。

表3 b 連翹苷回歸模型方差分析Table 3 b Analysis of variance for phillyrin regression model

由表3b可知，該模型的P＜0.0001，說明模型回歸高度顯著。回歸方程的相關系數(R2)為0.9490，說明模型響應值的變化94.90%來自所選考察變量。因此，回歸方程可以較好地描述考察因子與響應值之間的關系。其中液料比、乙醇濃度、浸提溫度對連翹苷提取率的影響最大，浸提時間對連翹苷提取率的影響最小。模型的一次項X1，X2，X4極顯著，X3不顯著;二次項X21、X22、X24顯著，X23不顯著;交互項均不顯著，這表明各影響因素對于連翹苷提取率的影響不是簡單的線性關系。失擬度的P值為0.1435＞0.05，對連翹苷得率影響不顯著，說明該模型的擬合度較好，可以利用該模型確定最佳工藝條件。

2.3.4 響應面圖分析

利用Design Expert軟件進行分析兩兩考察因素間交互作用的響應面圖，如圖2～3所示，可直觀反應各因素和響應值及各考察因子之間的交互作用，由圖2知，影響連翹酯苷A提取率的兩兩因素間交互作用比較顯著，而從圖3可知，影響連翹苷提取率的兩兩因素間交互作用不顯著。響應面圖全部開口向下，隨著每個因素值的增大，響應值增大，當響應值增大到極值后，又隨著因素值的增大逐漸減少，從響應面的最高點和等高線可看出在所選的范圍內存在極值，即該模型有穩定點，且穩定點是最大值。模型預測最優工藝條件為:液固比30 mL/g，乙醇濃度52.88%，浸提時間53.28 min，溫度74.35℃。

2.4 最優條件的驗證

為了檢驗上述模型方程的合適性和有效性，進行驗證試驗。按照響應面數據并根據實際條件得出最佳工藝條件:液固比為30 mL/g，乙醇濃度為53%，浸提時間為53 min，溫度為74℃。分別提取了3批樣品，經HPLC法測定連翹酯苷A的提取率分別為7.52%、7.58%、7.57%，平均提取率為7.56%，與模型的預測值(7.53%)的相對誤差為0.4%。連翹苷的提取率分別為3.02%、3.28%、2.96%，平均提取率為3.09%，與模型的預測值(3.03%)相對誤差為2.0%。可見該模型可以較好地反映出乙醇提取連翹酯苷A和連翹苷的條件。

3 結論

連翹苷和連翹酯苷A含量是我國藥典規定的連翹藥材的質控指標，也是連翹具有抗病毒抗氧化作用的重要活性組分，所以選擇上述兩種物質作為指標物質可以較為全面的反映連翹的品質。根據這兩種活性物質的理化性質，以及單因素實驗的結果，二者的提取條件具有一致性，故可同時以二者的提取率為響應值尋求最佳工藝條件。

響應面法能更好地處理離散的水平值，能夠更為準確地找出各因素的最佳組合和響應值的最優值。本試驗通過利用響應面法研究從連翹葉中提取連翹酯苷A和連翹苷的最佳工藝，得到最佳工藝條件為:液固比為30 mL/g，乙醇濃度為53%，浸提時間為53 min，溫度為74℃。該工藝提取率高，穩定性好，操作簡便，適合工業化生產。

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