巨尾桉葉中皂苷的提取分離及其抗氧化活性研究

黃 增，劉雄民，黃麗葵，陳華玲，黃紅銘

廣西大學化學化工學院，南寧530004

桉樹屬樹種有900余種，其中巨尾桉(Eucalyptus grandis x E.urophylla)是巨桉和尾葉桉雜交的速生樹種，為我國主要種植樹種之一。桉屬植物有效成分的研究集中在揮發油成分［1-3］。亦有文獻［4］指出，藍桉等多種桉屬植物中含有三萜類皂苷。陳婷等［5］對桉葉中抗菌有效部位進行了初步研究，陳海等［6］指出桉葉中多酚具有抗氧化性。但有關巨尾桉葉中皂苷的提取純化工藝仍未受到足夠重視。本文以水為溶劑，開展從巨尾桉葉中提取純化皂苷的工藝研究，探討提取物中皂苷的含量對抗氧化性的影響，為巨尾桉葉的開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巨尾桉桉葉:采摘于廣西大學校園。

齊墩果酸、石油醚、抗壞血酸、雙氧水、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚、二苯基苦基肼自由基(DPPH)、濃鹽酸等，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司); UV-2550紫外可見分光光度計(日本島津公司)等。

1.3 實驗方法

1.3.1 皂苷的提取

新鮮桉葉經水洗烘干后粉碎，過60目篩。稱取一定量的原料，用適量石油醚在70℃水浴中回流3 h脫除葉綠素，自然揮發溶劑至干，加入適量水，于一定溫度條件下浸提后，離心，上層清液用紫外可見分光光度計測定吸光度，將提取液濃縮后干燥，得到皂苷粗提物。

1.3.2 皂苷的分離純化

1.3.2.1 有機溶劑萃取法純化

將粗提液用旋轉蒸發儀濃縮，用等體積的乙醚溶液萃取3次，水飽和的正丁醇萃取6次，將上層正丁醇相合并并且濃縮，得到皂苷純化液，測定皂苷含量。

1.3.2.2 大孔樹脂吸附法分離純化

通過靜態吸附實驗，篩選出對皂苷具有較好純化效果的HPD300型樹脂，稱取100 g經過預處理的HPD300型樹脂，濕法裝柱，室溫下將濃度為6.76 mg/mL的粗提液以1.00 mL/min的流速通過大孔樹脂柱，待樹脂吸附飽和后，用蒸餾水洗柱至流出液無色，用2倍上樣量體積的90%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，測定含量。

1.3.2.3 大孔樹脂-丙酮沉淀聯用分離法

對粗提液進行離心后，過0.50 μm膜進行大孔樹脂上柱前預處理。稱取100 g經過預處理的HPD300型樹脂，濕法裝柱，室溫下將濃度為6.76 mg/mL的提取液以1.00 mL/min的流速通過大孔樹脂柱，樹脂吸附飽和后，蒸餾水洗柱至流出液無色，用2倍上樣量體積的70%乙醇洗脫，減壓濃縮洗脫液，再加以少量的甲醇溶解，緩慢加入丙酮，將產生的沉淀離心后棄取上層清液，多次沉淀直到上清液基本無色。用適量去離子水溶解，干燥即可回收純度較高的皂苷。

1.3.3 皂苷的分析方法

1.3.3.1 皂苷的定性分析方法

采用皂苷的泡沫反應、與乙酸酐-濃硫酸的顏色反應、紫外可見吸收光譜和液相色譜進行檢測分析。

1.3.3.2 皂苷含量的測定

按文獻［7］的方法，采用香草醛-高氯酸顯色分光光度法，以A548nm對齊墩果酸濃度(X)進行線性回歸分析，求得線性方程為Y=2847.7X-0.0326，相關系數R2=0.9989。取一定體積的皂苷提取液按該方法測定吸光值，用線性方程計算提取液中皂苷含量。

1.3.4 皂苷的抗氧化性能

配制一定皂苷濃度的桉葉粗提液、大孔樹脂純化液和大孔樹脂吸附-丙酮沉淀純化液，同時以抗壞血酸(VC)作為對比液。按照文獻［8］的方法，分別測定各溶液對DPPH自由基、過氧化氫以及超氧陰離子自由基的清除作用。

2 結果與分析

2.1 巨尾桉葉中皂苷的定性分析

2.1.1 皂苷的泡沫反應［9］

取樣品適量，加入少量水溶解并煮沸10 min左右，將提取液于試管中強烈振搖，提取液有蜂窩狀泡沫產生，并持續15 min以上，而空白對照液產生的泡沫在1 min內消失，該實驗現象表明存在皂苷。

2.1.2 皂苷的顏色反應［10］

取樣品適量，溶于乙酐中，緩慢滴加1滴濃硫酸，觀察到溶液由黃色變成紅色，之后變成淺綠色，最后逐漸褪去顏色，該實驗現象表明存在三萜類皂苷。

2.1.3 皂苷的紫外可見光譜及液相色譜特性

圖1 試樣的紫外可見光(a)及HPLC(b)色譜分析圖譜Fig.1 UV absorption(a)and HPLC(b)spectrum of samples

紫外可見光光譜如圖1(a)所示。經過香草醛-高氯酸顯色后，齊墩果酸標準品與純化樣品在548 nm處均有較強吸收。液相色譜特性如圖1(b)所示，在色譜檢測條件為:色譜柱Kromasil-100A C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇:水=95∶5，檢測波長210 nm，流速0.80 mL/min，柱溫30℃。此條件下齊墩果酸標準品與樣品出峰時間基本一致，推斷樣品中可能有三萜類皂苷物質。

2.2 提取條件對皂苷得率的影響

2.2.1 提取溫度對皂苷得率的影響

稱取10 g經預處理的桉葉粉，加入適量水使得液料比為20∶1，設置提取時間為6 h。考察溫度分別在30、40、50、60和70℃下對皂苷得率的影響。由圖2(a)可知，隨著溫度的升高，皂苷的得率增大。這是因為溫度升高使得分子的熱運動加劇，細胞壁受到破壞致使內部的皂苷浸出。為避免消耗更多能量，提取溫度以60℃為宜。

2.2.2 提取時間對皂苷得率的影響

稱取10 g經預處理的桉葉粉，加入適量水使得液料比為20∶1，設置提取溫度為60℃，考察提取時間分別在2、3、4、5和6 h下對皂苷得率的影響。由圖2(b)可知，隨著提取時間的增加，皂苷得率逐漸增大，之后皂苷的得率幾乎不變，這可能是由于一方面皂苷在提取5 h已經充分溶出了。另一方面，隨著提取時間的延長，皂苷可能少部分降解了。綜合考慮，浸提時間選擇為5 h。

2.2.3 提取液料比對皂苷得率的影響

稱取10 g經預處理的桉葉粉，設置提取溫度60℃，提取時間為5 h，考察提取液料比分別為12∶1、16∶1、20∶1、24∶1和28∶1下對皂苷提取得率的影響。由圖2(c)可知。隨著液料比的增大，皂苷的溶出率也在增大。當液固比大于20∶1時，皂苷得率增加幅度不大。從保證提取效果和降低濃縮負荷方面綜合考慮，液料比以20∶1為宜。

圖2 提取溫度(a)、提取時間(b)、液料比(c)對巨尾桉皂苷得率的影響Fig.2 The effect of extraction time(a)，extraction temperature(b)and ratio of liquid to solid(c)on yield of saponin

2.3 響應面法優化回流提取的工藝

根據Box-Behnken中心組合實驗設計原理，通過單因素試驗，選取提取溫度、提取時間、提取液料比這3個對桉葉皂苷得率影響較為顯著的因素，采用三因素三水平的響應面分析方法優化皂苷的提取工藝，如表1所示。

表1 Box-Behnken設計實驗因素水平及編碼Table 1 Factor level and coded of Box-Behnken design

表2 Box-Behnken實驗設計方案及實驗結果Table 2 Box-Behnken design matrix and response value for the yield of saponin

1 1 0 -1 1 4.0 5 1 2 0 1 1 4.1 0 1 3 0 0 0 5.5 5 1 4 0 0 0 5.6 0 1 5 0 0 0 5.4 2 1 6 0 0 0 5.4 0 1 7 0 0 0 5.5 1

以皂苷得率為響應值(Y)，響應面試驗設計與試驗結果見表2。試驗中，1～12是析因試驗;13～ 17是中心點重復試驗用來估計試驗誤差。

應用Design Expert軟件，對表2中的數據進行多元回歸擬合，選擇對響應值顯著的各項，可得桉樹葉水提液中皂苷的得率對提取溫度、提取時間和料液比的二次多項回歸方程為:Y=5.500+0.160A+ 0.025B+0.061C+0.025AB+0.003AC+0.025BC-0.450A2-0.750B2-0.720C2。

對回歸方程進行方差分析和顯著性檢驗，桉樹葉水提液中皂苷提取回歸分析結果見表3。

表3 回歸模型方差分析結果Table 3 ANOVA for the response surface quadratic polynomial model

對回歸方程進行檢驗，相關系數R2=0.9942，P＜0.0001，表明回歸模型顯著，擬和程度好。對系數進行顯著性檢驗(表3)，由F值可判定對指標影響的顯著性依次為A＞C＞B即溫度＞料液比＞時間，優化后得到的最佳工藝條件為:提取溫度61.81℃、提取時間5.02 h，液料比為20.09∶1，在此條件下桉葉中皂苷的得率為5.51%。

2.4 巨尾桉葉中的皂苷分離純化結果

表4 三種不同分離純化方法的純化效果Table 4 The purification effect comparison of different methods

由表4可知，經有機溶劑萃取純化后，桉葉中皂苷的含量由16.22%提高到20.11%。其回收率為54.34%，此方法需要消耗較多的溶劑，純化周期較長，但純度較低。經過HPD300樹脂一次純化后可得到為含量為 31.64%的皂苷，其回收率為72.18%，周期較短，回收率也較高，但純度較低。而采用大孔樹脂-丙酮沉淀聯用分離法可得到為含量為50.35%的皂苷，其回收率為65.41%，純度較高。

2.5 皂苷抗氧化性質研究

2.5.1 皂苷清除DPPH自由基的測定

為確定各試樣對DPPH·的清除效果，考察各試樣在0.01至0.60 mg/mL濃度范圍內的清除率。由圖3(a)可知，在較低濃度時，抗壞血酸、粗提物、大孔樹脂純化物和大孔樹脂吸附-丙酮沉淀純化物對DPPH·均有較高的清除率。在實驗濃度范圍內，粗提物和大孔樹脂純化物均在濃度為0.50 mg/ mL時有最大清除率，分別為83.02%和84.20%。大孔樹脂吸附-丙酮沉淀純化物在濃度為0.60 mg/ mL時有最大清除率，為85.62%。

2.5.2 皂苷清除過氧化氫(H2O2)的測定

為確定各試樣對H2O2的清除效果，考察各試樣在0.01至0.50 mg/mL濃度范圍內對H2O2的清除率。由圖3(b)結果可知，粗提物對H2O2的清除效果較明顯，兩種純化物對H2O2的清除效果稍低。在實驗濃度范圍內，粗提物、大孔樹脂純化物和大孔樹脂吸附-丙酮沉淀純化物均是在濃度為0.50 mg/ mL時有最大清除率，其清除率分別為80.10%、55.02%和48.21%。

圖3 不同濃度試樣對DPPH·(a)、H2O2(b)和O(c)的清除曲線Fig.3 DPPH free radical(a)，Hydrogen peroxide(b)and Superoxide anion radical(c)scavenging rates of different samples

3 結論

3.1 進行了巨尾桉葉有效成分的定性鑒定，結果表明，巨尾桉葉中所含的皂苷為三萜類皂苷。

3.2 進行了皂苷提取工藝優化研究，確定提取巨尾桉葉中皂苷的較優條件為:提取溫度61.81℃、提取時間5.02 h，液料比為20.09∶1，在此條件下皂苷的得率為5.51%。

3.3 對粗皂苷進行了分離純化方法的探索，采用溶劑萃取法、大孔樹脂吸附法以及大孔樹脂吸附-丙酮沉淀聯用分離法分別對桉葉水提液進行分離純化，經過對比得出較優的分離方法為大孔樹脂吸附-丙酮沉淀聯用法。該方法可得到含量為50.35%的皂苷，其回收率為65.41%。

3.4 開展了對桉葉提取物的抗氧化性能研究，結果指出，提取物對DPPH·有明顯的清除作用，隨著皂苷含量的增大，對DPPH·的清除率也相應增大，但未見顯著差異;在清除H2O2和O體系中，隨著試樣中皂苷含量的增加，試樣對H2O2和O清除能力有所下降，由此可知巨尾桉中皂苷對H2O2和的清除作用不顯著。

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