丙戊酸對大鼠急性脊髓損傷后BDNF及NT-3表達的影響

李新枝

成都醫學院人體解剖與組織胚胎學教研室，四川成都 610083

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后由于神經元無法再生以及繼發性損傷，造成運動和感覺功能障礙，嚴重影響患者生活質量，迄今為止尚無切實有效的治療方法。近年來研究表明，丙戊酸（valproic acid，VPA）具有多方面的神經營養效應和神經保護作用[1]，而有關VPA對SCI的影響及機制的報道很少。研究證實，腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）和神經營養素3（neurotrophin-3，NT-3）具有阻止神經元死亡和促進軸突再生的雙重作用[2]。本研究通過探討VPA對大鼠SCI后BDNF和NT-3表達的影響，為臨床治療SCI提供新方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇健康成年雄性SD大鼠60只，清潔級，體重250～300 g，由成都醫學院實驗動物中心提供。置實驗室環境中飼養1周，自由攝食和飲水。

1.2 試劑

丙戊酸（購自杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司），兔抗大鼠BDNF一抗，兔抗大鼠NT-3一抗，SABC免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒（均購自武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 脊髓損傷動物模型制作

大鼠術前12 h禁食，自由飲水。1%戊巴比妥（40 mg/kg）腹腔內注射麻醉后，采用改良的Allen法制作脊髓損傷動物模型：大鼠俯臥位固定，無菌條件下暴露T9～11椎板，咬除T10的棘突及椎板，以12.5 mm×10 g的能量撞擊，金屬桿下落后大鼠迅速出現搖尾反射，雙后肢及軀體回縮撲動，表明撞擊成功。對照組（C組）只做T10椎板切除術。

1.4 動物分組及處理

60只大鼠隨機分為損傷組（SCI組）、丙戊酸保護組（VPA組）和C組，每組又分為傷后24、48、72 h和1周4個時間點，每個時間點5只大鼠。VPA組術后即刻及其后每12 h皮下注射VPA 300 mg/kg；C組和SCI組在相應時間點注射等體積的生理鹽水。術后皮下注射青霉素（10 000 U/100 g）抗感染，SCI組大鼠給予人工排尿，每日2次。

1.5 BBB評分[3]

各組大鼠于術后24、48、72 h和1周行BBB評分。為保證評分的準確性，由3名非實驗人員了解評分標準后，各自評分，取平均值。

1.6 取材及樣品制備

大鼠采用1%戊巴比妥（50 mg/kg）腹腔內注射麻醉后行灌流固定，打開胸腔暴露心臟及主動脈根部，左心室插管至主動脈根部，剪開右心耳，灌注生理鹽水約200 mL，至流出液體澄清，換用4%多聚甲醛灌注約300 mL 40min，灌流固定成功后，依次剪開動物背部皮膚、肌肉，暴露損傷段脊髓，以損傷段為中心，切取約1 cm的脊髓段，4%多聚甲醛后固定24 h，常規石蠟包埋，從損傷中心連續橫切片，片厚5μm，備用。

1.7 腦源性神經營養因子和神經營養素3檢測

切片常規脫蠟水化后，用SABC法進行免疫組織化學染色。以胞漿出現棕黃色顆粒作為陽性判斷標準。光鏡下（10×40）每張切片隨機拍攝5個不重復的視野。用Image-Pro Plus（IPP）圖像分析軟件測量BDNF及NT-3免疫反應產物的平均吸光度值。

1.8 統計學方法

采用SPSS 12.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差表示，多組間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠BBB評分比較

C組各時間點運動功能均未受影響，評分均為21分，SCI組和VPA組的BBB評分在各時間點均顯著下降，但VPA組的評分在各時間點高于SCI組，SCI后48、72 h和1周兩組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠BBB評分比較（±s，分）

表1 各組大鼠BBB評分比較（±s，分）

注：與C組比較，*P＜0.05；與SCI組比較，#P＜0.05

組別 例數24 h（n=5）48 h（n=5）72 h（n=5）1周（n=5）SCI組VPA組C組20 20 20 0.33±0.27*0.42±0.17*21 2.42±0.32*4.08±0.31*#21 4.50±0.43*7.67±0.54*#21 5.53±0.65*10.78±0.36*#21

2.2 三組大鼠腦源性神經營養因子和神經營養素3表達情況比較

C組各時間點BDNF和NT-3均有少量表達，BDNF陽性產物主要位于神經元胞漿內，NT-3陽性產物在神經元和膠質細胞胞漿內均可見。SCI組和VPA組在傷后24 h即可見BDNF和NT-3表達明顯增加，BDNF的表達在傷后72 h達高峰，以后逐漸減少，1周時其表達水平仍明顯高于C組（P＜0.05）。NT-3的表達在傷后1周達高峰。與SCI組相比，VPA組的BDNF和NT-3陽性表達在各時間點均明顯增加（P＜0.05）。見表2、3。

表2 三組大鼠腦源性神經營養因子平均光密度比較（±s）

表2 三組大鼠腦源性神經營養因子平均光密度比較（±s）

注：與C組比較，*P＜0.05；與SCI組比較，#P＜0.05

組別 例數24 h（n=5）48 h（n=5）72 h（n=5）1周（n=5）SCI組VPA組C組20 20 20 118.24±11.13*167.04±8.86*#82.66±6.78 134.33±9.36*193.86±11.38*#80.24±4.53 168.35±9.27*212.76±10.04*#81.07±5.23 147.26±10.21*188.23±9.01*#82.76±6.84

表3 各組大鼠神經營養素3平均吸光度比較（±s）

表3 各組大鼠神經營養素3平均吸光度比較（±s）

注：與C組比較，*P＜0.05；與SCI組比較，#P＜0.05

組別 例數24 h（n=5）48 h（n=5）72 h（n=5）1周（n=5）SCI組VPA組C組20 20 20 91.08±6.32*126.49±11.38*#65.24±6.75 97.81±7.95*139.27±10.49*#62.14±5.67 102.18±8.49*149.29±11.13*#66.39±6.51 127.83±9.27*168.18±9.36*#61.83±7.21

3 討論

VPA是一種情緒穩定劑和抗癲癇劑，常用于雙相性情緒障礙的治療。近年來VPA的神經保護作用日益受到關注，研究發現，VPA具有阻斷谷氨酸誘導的興奮性中毒、減輕炎癥反應、抑制脂質過氧化和蛋白質氧化、抗凋亡等效應，對帕金森病、阿爾茨海默病等神經退行性疾病具有保護作用[4]。但VPA的神經保護作用機制目前尚不完全明確。神經營養因子（neurotrophic factors，NTFs）是機體產生的能支持神經元存活和促進軸突生長的一類蛋白質，包括神經營養素家族（NGF、BDNF、NT-3等）、膠質細胞源性神經營養因子家族、睫狀神經營養因子家族和成纖維細胞生長因子家族。研究證實，NTFs對神經細胞的發生、發育、分化和再生起重要作用，對神經病和精神病均具有潛在治療作用[5]。

SCI后的病理生理過程包括原發性損傷和繼發性損傷。原發性損傷是指受傷即時由機械性損傷所造成的細胞壞死和出血。繼發性損傷的機制還不完全清楚，目前已知的包括缺氧、缺血-再灌注、谷氨酸興奮性中毒、氧化應激、自由基形成和炎癥反應等，這一系列反應造成神經細胞進一步的壞死和凋亡。由于SCI后損傷局部缺乏NTFs以及存在軸突生長抑制因子等因素，造成神經細胞再生困難，因此，外源性補充NTFs或用藥物促進神經細胞自身合成和分泌NTFs，將有助于患者神經功能恢復。Sasaki等[6]研究發現，BDNF基因修飾的間充質干細胞移植比單純的間充質干細胞移植更能促進SCI后大鼠神經功能恢復和軸突生長，并且有助于損傷面積縮小，表明BDNF對SCI具有保護作用。Guo等[7]研究證實NT-3基因修飾的施萬細胞與神經干細胞聯合移植與單獨移植神經干細胞相比，有更多的神經干細胞向神經元分化。本研究VPA組的BDNF和NT-3表達與SCI組相比在各時間點均明顯增加，表明VPA可促進SCI后大鼠內源性的BDNF和NT-3表達。與本研究相似，Chen等[8]研究發現，VPA可刺激星形膠質細胞釋放NTFs，從而保護受損的多巴胺能神經元。

本研究BBB評分顯示，VPA組的評分在各時間點均高于SCI組，兩者相比在傷后48、72 h和1周差異有顯著性（P＜0.05），表明VPA可促進SCI后大鼠神經功能恢復，其機制可能與促進BDNF和NT-3表達相關。此外，筆者前期的研究表明，VPA可減少SCI后神經細胞凋亡，上調HSP 70表達[9]。另有研究發現，VPA通過促進內源性神經干細胞增殖從而對SCI發揮保護作用。最近有研究報道，VPA可抑制組蛋白脫乙酰基酶活性[10]，從而促進SCI后神經功能恢復。有關VPA對SCI保護作用的確切機制目前還不清楚，仍需進一步研究。

綜上所述，VPA通過促進BDNF和NT-3表達，從而對SCI發揮保護作用。由于VPA具有多方面的神經保護作用，其有望成為臨床治療SCI的備選藥物之一，因此有必要進一步深入探討其對SCI保護作用及其機制。

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[3]Bethea JR，Castro M，Keane RW，et al.Traumatic spinal cord injury induces nuclear factor-kb activation[J].J Neurosci，1998，18（9）：3251-3260.

[4]Monti B，Gatta V，Piretti F，et al.Valproic acid is neuroprotective in the rotenone rat model of Parkinson's disease：involvement of alpha-synuclein[J].Neurotox Res，2010，17（2）：130-141.

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[10]LU L，Sun Y，Han X，et al.Valproic acid improves outcome after rodent spinal cord injury：potential roles of histone deacetylase inhibition[J].Brain Res，2011，1396：60-68.