結球甘藍離體下胚軸不定芽再生研究

李 貴，陶 鵬，李必元，王五宏，岳智臣，鐘新民

(1.浙江省農業科學院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021;2.南京農業大學 作物遺傳與種質創新國家重點實驗室，江蘇 南京 210095)

結球甘藍 (Brassica oleracea L.var.capitata L.)屬十字花科蕓薹屬，是甘藍 (Brassica oleracea L.)的一個亞種，起源于地中海沿岸［1］，是我國的主要蔬菜作物之一。近年來為了提高植物的抗病性和抗逆性，利用農桿菌介導的植物基因工程技術將目的基因導入，可在保持原有優良背景的基礎上改良目標性狀，為品種改良開辟了新的途徑。植物外植體的離體培養，建立高頻率的再生體系是基因轉化技術中的關鍵環節。通常情況下，離體再生頻率越高，轉化頻率也越高［2］。前人研究結果表明，植株外植體的高效再生與很多因素有關，不僅與植物生長調節劑的類型、濃度有關，還與外植體類型、基因型、生理狀態及乙烯抑制劑的應用有關［3-5］。本試驗在前人研究的基礎上，以結球甘藍強力50(QL50)和甘19CMS的下胚軸為外植體，研究不同激素配比、Ag+、外植體的生理狀態 (苗齡)等對下胚軸外植體再生的影響，以建立高效的結球甘藍下胚軸再生體系，為下一步的基因轉化研究奠定基礎。現將有關結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為結球甘藍強力50和甘19CMS，均由浙江省農業科學院蔬菜研究所提供，取其無菌實生苗下胚軸為外植體。

1.2 方法

1.2.1 無菌苗培養

將結球甘藍的種子用清水沖洗干凈，置于75%的酒精中浸泡0.5 min，用0.1%的HgCl2表面消毒3 min，最后用無菌水沖洗4次，接種于無激素的 MS(蔗糖30 mg·L-1+瓊脂7 mg·L-1，pH為5.8)培養基上。于 (25±2)℃、光照強度1 800 lx，16 h光/8 h暗的光周期培養無菌苗。

1.2.2 不同激素組合試驗

不同激素組合，設6-BA濃度0，1，2，3，4 mg·L-1，與 NAA 濃度 0，0.02，0.2，0.5，0.8 mg·L-1進行完全隨機組合。在材料適宜苗齡時，切取0.5 cm長的下胚軸放入加有不同激素組合的MS(蔗糖30 g·L-1，瓊脂7 g·L-1)分化培養基中。用培養皿進行培養，每皿接種40個外植體，重復3次。培養20 d后，調查不定芽的生長情況。

1.2.3 AgNO3與激素組合試驗

從上步試驗出芽較好的激素組合再與不同濃度的 AgNO3(0，2，4，6，8，10 mg·L-1)設計組合進行外植體培養。AgNO3采用過濾滅菌。培養20～25 d統計不定芽分化率。1.2.4 苗齡試驗

在篩選出來的出芽較好的培養基上接種取自不同苗齡 (3，6，9，12，15，18，21 d)的外植體。培養20～25 d統計不定芽分化率。

1.2.5 不定芽生根與植株移栽

當分化培養基中的不定芽長到2～3 cm時，切取后轉入含不同生長素的1/2 MS培養基 (IBA 0.2，0.5 mg·L-1，NAA0.2，0.5 mg·L-1)中，待芽基部形成大量的毛根后，打開三角瓶口，煉苗4～5 d后取出小植株，洗凈根部培養基，移栽到基質中，篩選適宜結球甘藍生根的培養基。

1.3 不定芽再生頻率與再生系數的計算

不定芽再生頻率/%=(再生不定芽的外植體數/接種外植體總數) ×100;不定芽再生系數(單個外植體再生芽數)=外植體再生的不定芽總數/再生不定芽的外植體總數。

2 結果與分析

2.1 不同激素濃度對不定芽再生的影響

外植體接種于不同激素濃度的誘導培養基4～5 d后明顯增大，大多數不定芽于接種后15～25 d之間產生，接種后1個月左右仍有極少數不定芽發生。細胞分裂素與生長素濃度的不同配比影響下胚軸誘導不定芽的頻率，不同激素組合的再生頻率結果 (表1)表明:6-BA和NAA對結球甘藍不定芽的誘導都是必要的，在MS培養基上單獨添加各種濃度的NAA或6-BA，其下胚軸外植體均不能再生不定芽，在不含任何激素的MS培養基上，也不能再生不定芽，大部分外植體在接種后15 d左右褐化死亡;在6-BA與NAA組合中，隨著6-BA濃度的升高，2個品種的不定芽再生率和再生系數略有上升;在6-BA的濃度一定時，不定芽再生率隨著NAA濃度的升高而降低，當NAA濃度高于0.5 mg·L-1時，不定芽再生率開始明顯下降;在NAA濃度為0.02 mg·L-1的處理中，QL50下胚軸的再生頻率隨著6-BA濃度的增加相應增加，當6-BA的濃度為2 mg·L-1時，其下胚軸不定芽再生頻率達到最高 (圖 1中 A)，為 89.13，再生系數為7.17，單個外植體上再生的不定芽數最高可達24個 (圖1中B);在 NAA濃度為0.2 mg·L-1，6-BA的濃度為2 mg·L-1的處理中，甘19CMS不定芽再生頻率達到最高，為64.67，再生系數為5.8;在NAA濃度為0.8 mg·L-1的處理中，2種材料的下胚軸不定芽再生頻率明顯下降，且在切口處有大量的不定根長出，大部分外植體在接種后20 d左右黃化褐死，再生率極低。

表1 NAA與6-BA配合對結球甘藍離體下胚軸不定芽再生的影響

2.2 AgNO3濃度對不定芽再生的影響

由表2可知，QL50在 9 d苗齡時，下胚軸在分化培養基MS+0.02 mg·L-1NAA+2 mg·L-16-BA;甘19CMS在苗齡6 d時，下胚軸在分化培養基 MS+0.2 mg·L-1NAA+2 mg·L-16-BA中分別添加2，4，6，8，10 mg·L-1的 AgNO3后，外植體的不定芽再生率隨AgNO3濃度的升高而升高后下降。當AgNO3濃度為6 mg·L-1時，外植體的不定芽再生率由原來不添加 AgNO3時的89.1%和64.7%分別增高到93.0%和70.9%，平均再生系數分別達到9.17和6.97，隨AgNO3濃度的繼續升高，不定芽再生頻率和再生系數均下降，并發現AgNO3濃度過高，外植體切口處褐化，再生的畸形芽也多，隨濃度變高，褐化現象越嚴重。說明適當濃度的AgNO3對子葉不定芽再生有顯著的促進作用。

表2 AgNO3對結球甘藍離體下胚軸不定芽再生的影響

2.3 苗齡對不定芽再生的影響

由表3可以看出，不同苗齡QL50下胚軸在分化培養基 MS+0.02 mg·L-1NAA+2 mg·L-16-BA，甘19CMS下胚軸在分化培養基MS+0.2 mg·L-1NAA+2 mg·L-16-BA中，下胚軸的不定芽再生率隨著苗齡增加均不斷增加，QL50下胚軸在9 d苗齡時再生率最高，達到89.1%，甘19CMS在6 d苗齡時再生率最高，達到69.2%;隨著苗齡的增加再生率均不斷降低，當到了15 d苗齡時再生率極低，當苗齡21 d時再生頻率基本為零，外植體全部褐化死亡。

表3 不同苗齡對結球甘藍離體下胚軸不定芽再生的影響

2.4 不定芽的生根

由表4可知，再生的不定芽在含有0.5 mg·L-1NAA的培養基上生根效果最好，再生的主根較多 (圖1中C)，而在含有0.5 mg·L-1IBA的培養基上再生的須根較多，再生的主根的數量很少(圖1中D)。不定芽在生根培養基中20 d后可形成較多的不定根，此時獲得完整的再生植株 (圖1中E)。再生植株經馴化煉苗后移入營養缽中，套塑料袋保濕。1周后去袋，再培養15 d左右，移栽到大花缽中讓其充分生長，直至現蕾、開花。

圖1 QL50下胚軸再生系統的建立

表4 不同生長素對不定芽誘導生根的影響

3 小結與討論

在植物離體培養中，外源細胞分裂素、生長素對不定芽的誘導和生長發育具有重要作用。一般認為，細胞分裂素與生長素質量濃度的適宜配比是植物不定芽分化的重要條件，細胞分裂素有利于芽的誘導分化，生長素有利于根的誘導分化，二者同時使用，質量濃度比值高時產生芽，質量濃度比值適中時可維持原組織生長而不發生分化［6-7］。十字花科蕓薹屬作物在無性繁殖時，添加一定質量濃度的外源激素能夠促進外植體不定芽的分化［8］。在本試驗中，誘導結球甘藍下胚軸再生不定芽時，選用6-BA和NAA 2種激素，在適宜濃度配比時能誘導出大量的不定芽，在只含有6-BA或NAA的培養基中，外植體均不能誘導出不定芽，這說明在不定芽的誘導過程中，細胞分裂素和生長素都是必須的，并且要求適宜的激素配比才能高效的誘導外植體不定芽的產生。這與許念芳等［9-18］的試驗結果一致。

植物細胞在離體培養過程中會產生乙烯，其過度積累會影響外植體的生長和不定芽的分化。據報導，在用外植體誘導不定芽的培養基中加入AgNO3可顯著的提高蕓薹屬植物的植株再生頻率［19-22］。本研究發現在培養基中添加AgNO3后，再生率可提高;但隨著AgNO3濃度的繼續升高，不定芽再生頻率和再生系數均下降，并且試驗中發現AgNO3濃度過高，外植體部分褐化，再生的畸形芽也多，濃度越高，褐化現象越嚴重。說明適當濃度的AgNO3對不定芽再生有促進作用，而較高濃度的AgNO3對不定芽再生具有一定的副作用，這與前人的研究結果相一致［23］。

外植體的生理狀態對不定芽再生的影響較大，選用適宜苗齡的無菌苗外植體能夠獲得較高的再生頻率。有研究表明，不同取材時期的甘藍下胚軸，其不定芽的分化有較大的差別［24］。本研究的試驗結果與此一致，當苗齡在6～9 d時，不定芽的分化頻率最高;當苗齡在15 d時，不定芽的分化頻率非常低;當苗齡21 d時不定芽的分化頻率基本為零。

根系健壯是試管苗成為再生植株的重要保證。有研究表明［25］，在不定根形成過程中，生長素起著主要作用。本研究結果發現再生芽在含IBA和NAA 2種激素的培養基上均能生根，但是NAA處理中不定芽再生的根系主根明顯要比IBA處理中的多，再生苗更容易成活。

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