瘦肉精三合一膠體金快速檢測板的研制及在畜肉中的應用

王 森，周亞蓮，盛慧萍，桑麗雅，馬秋玲，楊光瑞，周建昌

(1.浙江省紹興市農業科學研究院，浙江 紹興 312000;2.杭州南開日新生物技術有限公司，浙江杭州 310022)

瘦肉精是一類 β-腎上腺受體激動劑，β-腎上腺素受體激動劑 (簡稱β-興奮劑)是具有苯乙醇胺結構的一類物質，可分為含取代基的苯胺型(如鹽酸克倫特羅)、苯酚型 (如沙丁胺醇)、苯二酚型 (如特布他林)三大類，主要包括鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺以及沙丁胺醇、溴布特羅、溴氯布特羅、馬布特羅等［1］。

β-受體激動劑早期主要用于防治人、動物支氣管哮喘和支氣管痙攣，后來研究發現在飼料中添加這類藥物具有營養再分配作用，促進動物生長和改善動物胴體結構，提高瘦肉率的作用，因此，該類藥物曾被作為一種藥物促生長添加劑被廣泛用于動物生產［2］。但是人們食用了殘留有這些藥物的畜肉產品后會出現面色潮紅、頭痛、頭暈、胸悶、心悸、四肢麻木等不良反應癥狀，嚴重的可能危及生命［3-4］。因此，歐盟、美國等都先后立法禁止在畜禽生產上使用該類藥物，我國農業部公告第235號(2002)規定嚴禁在畜牧生產上使用各種β-興奮劑類藥物［5］。

目前，國內外動物性食品中β-受體激動劑在實驗室內的檢測方法主要是氣相色譜-質譜法(GC-MS)［6-7］，GC-MS 作為確證方法具有靈敏度高、精確性好的優點，但操作煩瑣、成本高。瘦肉精膠體金快檢卡是當前β-興奮劑類檢測最主流的現場快速篩選方法，市場占有率遠遠超過酶聯免疫吸附法 (ELISA法)，以檢測尿液為主，但尿樣檢測存在弊端。相對來說，檢測畜肉組織中β-興奮劑殘留量更為穩定和準確。本研究研制了一種檢測畜肉組織中3種瘦肉精殘留的膠體金快速檢測板。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

鹽酸克倫特羅 (CLEN)、萊克多巴胺(RAC)、沙丁胺醇 (SAL)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白 (OVA)、氯金酸 (HAuCl4·4H2O)、羊抗鼠IgG均購自美國 Sigma公司;聚乙二醇20000購自華東醫藥有限公司;硝酸纖維素膜、膠體金結合墊、樣品墊均購于Millipore公司;抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體、抗萊克多巴胺單克隆抗體、抗沙丁胺醇單克隆抗體均由杭州南開日新生物技術有限公司提供。

1.1.2 儀器

Avanti J-26XP高速冷凍離心機 (美國 Becman公司)、UV-2802紫外連續掃描分光光度計 (美國UNICO公司)、78HW-1恒溫磁力攪拌器 (杭州儀表電機有限公司)、恒溫鼓風干燥箱 (上海精宏實驗設備有限公司)、BioJet XYZ3000型點膜儀 (美國BioDot公司)、切割機 (杭州市恒通設備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 特異性結合抗原的制備及鑒定

鹽酸克倫特羅特異性結合抗原的制備采用重氮法。稱取100 mg BSA，用10 mL 0.1 mol·L-1pH值10.0的碳酸鈉緩沖溶液溶解，得到溶液A。另外稱取20mg鹽酸克倫特羅，用2mL 0.5 mol·L-1的硫酸溶液溶解，混勻后加入300 μL 10 mg· mL-1的亞硝酸鈉，持續反應2 h，得到溶液B。在攪拌下，將溶液B逐滴加入溶液A中，混勻后，置于4℃下避光反應5 h(期間可顛倒混勻)，之后用0.01 mol·L-1pH值7.4的 PBS緩沖液透析4 d，期間每間隔8 h換液1次。再將溶液離心，收集上清液，-20℃下凍存備用。

萊克多巴胺特異性結合抗原的制備采用混合酸酐法。34 mg鹽酸萊克多巴胺溶于2 mL吡啶，加入12 mg戊二酸酐;室溫下攪拌過夜;氮氣吹干吡啶;0.1 mmol·L-1萊克多巴胺半抗原溶解到4 mL DMF N'N-二甲基甲酰胺 ∶1，4-二氧六環 (V∶V為1∶1)，添加26.2 μL三正丁胺;上述混合物冰浴攪拌10 min，加入14.3 μL氯甲酸異丁酯，恢復到室溫，攪拌反應1 h;上述混合物逐滴加入到預冷BSA溶液中 (100 mg BSA溶于pH值8.5 0.1 mol·L-1硼酸鈉溶液)，混合物恢復到室溫，攪拌過夜;用0.01 mol·L-1pH值7.4的 PBS緩沖液透析3 d，每天換液3次。

沙丁胺醇特異性結合抗原的制備采用混合酸酐法。稱取240 mg沙丁胺醇堿，用20 mL甲醇溶解;旋轉蒸發為黃色油狀物;再用無水乙醇溶解，逐滴加入乙醇溶解的120 mg丁二酸酐;氮氣保護條件下，室溫攪拌4 h;將反應液離心，棄上清液;用無水乙醇洗滌沉淀物3次;揮干溶劑所得白色固體即半抗原沙丁胺醇半琥珀酸。

稱40 mg半琥珀酰沙丁胺醇，溶于1，4-二氧六環-水-三乙胺的混合物中;攪拌下逐滴加入30 μL氯甲酸異丁酯 (30 min內);將上述反應液逐滴加入到25 mL含80 mg BSA的蒸餾水中;4℃反應過夜;0.01 mol·L-1pH值7.4的PBS緩沖液透析3 d，每天換液3次。

抗原的鑒定。合成的鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇特異性結合抗原稀釋成 100 μg·mL-1(蛋白濃度)后做200～400 nm波長的紫外掃描。比較半抗原、載體蛋白和偶聯物的紫外光譜圖，判斷偶聯是否成功。

1.2.2 抗體-膠體金標記物的制備

膠體金溶液的制備。采用檸檬酸三鈉法［8］，制備粒徑為30 nm左右的膠體金溶液。

標記前分別將抗鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇單克隆抗體溶液以1 5 000 r·min-14℃離心30 min，取上清液;取已制備好的膠體金溶液100 mL，用 0.1 mol·L-1K2CO3和 0.1 mol·L-1HCl將膠體金溶液的pH值調至8.0～8.2。邊攪拌邊分別加入最適量的單克隆抗體，加入蛋白質時應逐滴加入，1 mg的蛋白質大約5 min加完;在攪拌下加入5%的BSA使其終濃度為1%，或加入3%聚乙二醇 (PEG MW 20 000)使其終濃度為0.05%;12 000 r·min-1離心 25 min，棄上清液;加入10 mL 0.01 mol·L-1pH值 7.4的 PBS緩沖液 (含 0.4 mol·L-1PEG 20 000)，12 000 r·min-1下離心25 min，棄上清液，如此洗滌 2～4次，以徹底除去未結合的蛋白質;將沉淀用10 mL含2% BSA的 PBS緩沖液 (pH值7.4，0.01 mol·L-1)溶解;用0.22 μm無菌過濾器過濾后，4℃保存備用。

1.2.3 檢測板大卡的組裝

檢測線、控制線及膠體金結合墊的包被。

用點膜機把適當質量濃度的特異性結合抗原(CLEN-BSA、RAC-BSA、SAL-BSA)、羊抗鼠 IgG噴在硝酸纖維素膜 (NC膜)上，分別作為檢測線(T線)和控制線 (C線)。

將制備好的金標記單克隆抗體用點膜機噴到玻璃纖維素膜上，作為膠體金結合墊。

特異性結合抗原、羊抗鼠IgG和金標抗體包被量的選擇方法。在 T線粗調范圍0.6～1.0 mg·L-1內和C線粗調范圍0.6～1.5 mg·L-1內，選擇一組質量濃度，按常規噴量0.8～1.0 μL·cm-1包被到NC膜上，60℃干燥箱放置2 h。將制備好的金標記抗體溶液選擇不同包被量(1.0～2.0 μL·cm-1)包被到玻璃纖維素膜上，33℃烘箱干燥12 h。

檢測板各組分的組裝。將樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊用不干膠依次粘貼在底板上組裝成大卡 (圖1)。

1.2.4 檢測板各組分的優化

圖1 檢測板的結構組成

用切割機將組裝好的大卡切割成4 mm寬的試紙條，裝入塑料模板中組裝成三合一檢測檢測板(圖 2)。

用 0.01 mol·L-1、pH 值 7.4的磷酸鹽(PBS)緩沖液和含1.0 μg·L-1鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的標準品溶液，各取100 μL分別進行試紙條滴定，觀察顯色變化和試紙條靈敏度，反復調試，最終選擇顯色深淺適中、靈敏度最高、梯度最大的一組特異性結合抗原、羊抗鼠IgG和金標抗體質量濃度作為最終配比。

圖2 鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇膠體金快速檢測檢測板

1.2.5 樣品前處理

樣品粗提處理。稱取4 g左右剪碎的畜禽肉樣本裝于5 mL刻度冷凍管中，蓋緊管蓋，于90℃以上水浴鍋中煮10 min;冷卻至常溫后，取3滴煮出的溶液 (盡量吸取肉汁中上清)于1.5 mL離心管中，再加入3滴CLEN專用PBST緩沖液，充分混合，待檢。L樣品精提處理。取去脂肪組織樣本于均質機中均質1 min(10 000 r·min-1);稱取2.5 g均質物于15 mL離心管中，加入5 mL 0.1 mol·L-1HCl，振蕩混勻 10 min;加入 100 μL 4 mol·L-1NaOH，劇烈振蕩30 s后，室溫下4 000 r·min-1離心15 min;轉移全部上清于15 mL離心管中，加入 50 μL 4 mol·L-1NaOH，振蕩混勻，再加入8 mL乙酸乙酯，振蕩5 min;取上層有機相6 mL于試管中，65℃氮 (空)氣吹干;向吹干的試管中依次加入0.3 mL正己烷和0.3 mL RAC專用PBST緩沖液，充分溶解試管壁上殘留物，靜置分層后，吸取至少100 μL下層溶液檢測。

1.2.6 檢測步驟及結果判斷

用滴管吸取待檢樣品，垂直滴加3滴 (約100 μL)于每個加樣孔中，加樣后開始計時;結果應在3～5 min讀取，其他時間判讀無效。

肉眼觀察樣品檢測結果，檢測線 (T線)顯色比控制線 (C線)深或一樣深為陰性 (表明樣品中對應待檢藥物濃度低于檢出限，或不含待檢藥物，圖3中a);檢測線 (T線)比控制線 (C線)淺，或檢測線 (T線)無顯色為陽性 (表明樣品中對應待檢藥物大于等于檢出限，圖3中b)。未出現C線，見圖3中c，可能是操作不當或檢測板已失效，應重新進行測定。

圖3 免疫膠體金快速檢測檢測板結果的判斷

1.2.7 檢出限測定

取經 LC-MS/MS法［9］確證的陰性畜禽肉樣品，分別添加CLEN、RAC、SAL標準品溶液制成含量為0，3.0，5.0，8.0 和10.0 μg·kg-1的樣品各10個，樣品通過粗提處理和精提處理后用本研究制備的三合一檢測板進行測定，確定檢出限。

1.2.8 與儀器方法的比對

隨機取10份畜禽肉樣品，作為供試試樣。每份樣品分別用LC-MS/MS法和本研究制備的瘦肉精三合一快速檢測板進行檢測，比較檢測結果。

2 結果與分析

2.1 特異性結合抗原的鑒定

鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇特異性結合抗原的紫外掃描圖譜 (圖4)。通過圖譜可以看出，偶聯后的 CLEN-BSA、RAC-BSA、SAL-BSA的特征吸收波峰均發生偏移，根據吸光度加合性原理，表明偶聯成功。

圖4 紫外掃描的圖譜

2.2 檢出限

CLEN、RAC、SAL含量為 0，3.0，5.0，8.0和10.0 μg·kg-1的樣品通過粗提處理后，用瘦肉精三合一膠體金快速檢測板進行檢測，結果含量為0和3.0 μg·kg-1的樣品檢測結果均為陰性，含量為5.0，8.0和10.0 μg·kg-1的樣品檢測結果均為陽性，故該檢測板對畜禽肉樣品中 CLEN、RAC、SAL的檢測限為5.0 μg·kg-1(簡單前處理)。檢測板檢測顯色結果見圖5。CLEN、RAC、SAL含量為 0，0.5，1.0和 2.0 μg·kg-1的樣品通過精提處理后，用檢測板進行檢測，結果含量為0和0.5 μg·kg-1的樣品檢測結果均為陰性，含量為1.0和2.0 μg·kg-1的樣品檢測結果均為陽性，故該檢測板對畜禽肉樣品中CLEN、RAC、SAL的檢測限為 1.0 μg·kg-1(復雜前處理)。檢測板檢測顯色結果見圖6。

圖5 檢測板檢測0～10.0 μg·kg-1樣品的顯色結果

2.3 與儀器方法的比對

10份畜禽肉盲樣經液相色譜-串聯質譜法檢測，其中，5份樣品未檢出瘦肉精殘留，另5份樣品分別檢出陽性 (樣品 S-1:CLEN 2.81 μg·kg-1，樣品 S-3:CLEN 1.01 μg·kg-1、RAC 1.32 μg·kg-1、 SAL 2.97 μg·kg-1， 樣 品 S-5:RAC 2.35 μg·kg-1、SAL 1.43 μg·kg-1，樣品 S-8:RAC 3.13 μg·kg-1， 樣 品 S-10:SAL 4.62 μg·kg-1)。這些樣品同時用瘦肉精三合一膠體金快速檢測板檢測 (復雜前處理)，結果與液相色譜-串聯質譜法檢測結果完全符合 (表1)。

圖6 檢測板檢測0～2.0 μg·kg-1樣品的顯色結果

表1 膠體金快速檢測板與液相色譜-串聯質譜法檢測結果的比較

3 小結和討論

影響膠體金檢測檢測板質量的因素較多，除特異性結合抗原、特異性抗體的特性外，還包括膠體金顆粒大小、抗原抗體包被量配比等。

膠體金顆粒制備好壞非常重要。如果金顆粒太小就不能產生足夠的顏色信號，導致目測效果較差;如果太大在標記時又會遇到空間位阻的問題。本試驗選用了直徑為30 nm左右的膠體金。

特異性結合抗原、羊抗鼠IgG和金標抗體包被量是決定檢測板靈敏度的3個主要變量。T線上特異性結合抗原包被量過小，顯色太淡，會影響視覺效果，反之包被量過大，雖然顯色深，但是靈敏度會降低。金標抗體的標記量由抗體特性決定，調試變量是其包被量。包被量的選擇依據一是顯色深淺，二是靈敏度高低，需反復調試確定最佳配比。

組織中克倫特羅等瘦肉精殘留主要是螯合物的形式存在，在堿性條件下利于提取。但是抗原抗體反應需要在近中性的條件下進行，所以樣品墊緩沖體系的調節作用至關重要，如果太偏堿，則跑板速度變慢導致顯色偏淺。如果太偏酸，會導致主要依靠靜電結合的抗體與金顆粒分離，造成檢測線和控制線不顯色或顯色淺，易造成假陽性和假陰性。

本研究制備的瘦肉精三合一膠體金快速檢測檢測板，一次樣品前處理可以同時檢測畜禽肉中鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇3種瘦肉精藥物，檢出限低，準確率高，且操作簡單快速，特別適合廣大基層部門對畜禽樣品進行大規模篩選。

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