萘對海洋三角褐指藻生長的毒性效應及生化指標研究

李艷梅,曾文爐,余 強,周啟星 (南開大學環境科學與工程學院,環境污染過程與基準教育部重點實驗室,天津市城市生態環境修復與污染防治重點實驗室,天津 300071)

萘對海洋三角褐指藻生長的毒性效應及生化指標研究

李艷梅,曾文爐,余 強,周啟星*(南開大學環境科學與工程學院,環境污染過程與基準教育部重點實驗室,天津市城市生態環境修復與污染防治重點實驗室,天津 300071)

選擇在海洋中分布廣泛的浮游植物海洋硅藻門的三角褐指藻(Phaeodactylum tricomutum) 作為目標生物,研究了不同萘濃度水平對海洋微藻的生態毒性效應,并同步監測了萘的真實濃度.結果表明,在0~168h內,與對照相比,低濃度萘(初始濃度為0.048~2mg/L)處理組藻的吸光度以及葉黃素、胡蘿卜素含量無明顯差異.但當萘處理初始濃度達到8mg/L甚至更大時,吸光度、葉黃素和胡蘿卜素含量隨萘濃度增加而迅速下降,呈現一定的濃度-效應關系.隨萘濃度的升高,各處理組中藻類體內超氧化物歧化酶(SOD)活性呈現先升高后下降的“鐘形曲線”趨勢,而藻類脂質過氧化產物丙二醛(MDA)的含量則呈現先略降低而后急劇上升的趨勢.

水體污染；海洋三角褐指藻；萘；毒性效應

近年來,世界范圍內的海上溢油事故頻發,給海洋生態系統造成了嚴重的破壞.萘是石油多環芳烴最主要的成分之一[1].在原油中,相對于其他高分子量的多環芳烴(含 3~6個環),萘的濃度更高.因此,萘成為溢油對海洋生態風險評估的特征污染物之一[2].

作為海洋生態系統中的最主要初級生產者,海洋微藻是許多海洋生物活性物質的最初來源,是海洋生物資源的重要組成部分.它們的盛衰直接或間接地影響著整個海洋生態系統的生產力[3].研究表明[4],海洋微藻對溢油的生態毒害反應靈敏,且呈現種類差異性.低濃度溢油的長期作用,將導致包括微藻在內的浮游生物種群結構發生變化[5].

海洋硅藻是近海海洋浮游植物的主要類群,其數量和種類均可占 90%以上,是近海初級生產力的主要貢獻者[6].海洋三角褐指藻屬硅藻門,對鹽度和溫度都具有極強的適應性,易于培養.因此,選取海洋三角褐指藻作為目標生物,研究萘對三角褐指藻的毒性效應,探討萘對其葉綠素含量、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量等生化指標的影響,并同步測定了外源萘在海水中的濃度變化趨勢,旨在探索檢測海洋生態系統溢油污染的生態指標,并為揭示該類化合物對海洋三角褐指藻的毒性機制提供科學依據.

1 材料和方法

1.1 藻種培養條件

實驗所用海洋三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)購自于青島中國海洋大學.實驗前,接種3~4次使細胞達到同步培養.

藻種于 SPX-300I-C型人工氣候箱中培養,培養溫度為(24±1)℃,光照強度為 4000lx,光暗比為12h:12h.培養液選用f/2營養鹽配方[7],實驗海水取自渤海口(鹽度為32.0±0.1,pH值為7.6±0.2),經 0.45μm 濾膜抽濾煮沸消毒,冷卻后配制培養液,每天定時人工搖動3次.

1.2 試劑與儀器

萘(純度≥99.8%)購自北京百靈威化學技術有限公司.配制40g/L的萘的二甲基亞砜(DMSO) (色譜純)儲備液,封口膜密封,每一個月重新配制一次.試驗工作溶液均是當天配制.

Waters高效液相色譜儀(HPLC):(Waters 1525 Binary HPLC Pump,Waters 717 plus Auto sampler,Waters 2487 UV Detector)、SPX-300I-C型人工氣候箱(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)、TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)、Universal 32R高速冷凍離心機(德國)、SHB-IIIS循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司).

1.3 試驗設計和方法

以DMSO作為助溶劑,試驗處理組分別為含0.048,0.096,2,8,16,32,64mg/L萘濃度的 f/2培養液, 以不添加萘的 f/2培養液作為對照 (預實驗結果表明,DMSO對藻類的生長影響不大,無顯著性差異(P<0.01),結果與以往研究結果[8]類似).同時,預實驗結果表明完全封閉的環境不利于藻類的呼吸作用,本試驗中綜合考慮到藻類呼吸作用和萘的揮發,采用硅膠塞塞住三角瓶口,并用封口膜封住,外層再覆一層保鮮膜[9].

培養液體積均為150mL,置于光照培養箱中進行一次性培養,按1:4的比例接種.每個萘濃度組設置 3個平行,分別在 0,24,48,72,96,120,144, 168h進行取樣測定相關生理生化指標.

1.3.1 海洋三角褐指藻光密度測定 采用TU-1901雙光束紫外可見分光光度計,在683nm處測定光密度 OD683nm,建立海洋三角褐指藻細胞密度Y和光密度X之間的線性關系(Y=-43.5+ 1058.6X,r2=0.9932).以式(1)[10]藻細胞生長抑制率計算萘對海洋三角褐指藻的毒性效應.

式中: Ct0表示 t時刻空白培養液藻細胞光密度; Ct表示t時刻含萘培養液中藻細胞的光密度.

1.3.2 葉綠素的提取與含量的測定 用分光光度法測定藻色素含量[11].每隔24h取20mL藻液,使用孔徑為 0.45μm的醋酸纖維濾膜(?50cm)抽濾,將濾膜放入10mL具塞離心管中,加入分析純95%乙醇 10mL,蓋上塞子,于 78℃水浴中加熱5min并搖動數次,冷卻后室溫置于黑暗條件下靜置24h,取出后以4000 r/min離心15min,上清液倒入 1cm玻璃比色皿,以 95%乙醇作參比,在470nm、649nm和664nm波長下測定吸光度,根據式(2)~式(4)[12]計算出葉黃素和胡蘿卜素含量.

1.3.3 酶活測定 提取粗酶液:取50mL藻液放入離心管(50mL)中,4000r/min離心20min,棄上清液,用預冷的 0.05mol/L(pH7.0)磷酸緩沖液淋洗藻沉淀并轉入預冷的研缽中,加入少量石英砂冰浴研磨.接著用 0.05mol/L(pH7.0)磷酸緩沖液,將勻漿液沖洗入 10mL離心管中,并定容至 5mL. 8000r/min離心 20min,上清液即為所需粗酶液,置于-80℃冰箱中保存待測.

超氧化物岐化酶(SOD)[13]測定:采用氮藍四唑(NBT)光化學還原反應法,反應總體積為 5mL,其中 5×10-3mol/L 磷酸緩沖溶液(pH 7.8), 75×10-6mol/L氮藍四唑,13×10-3mol/L蛋氨酸, 2×10-6mol/L核黃素,1×10-6mol/L Na2EDTA;藻細胞酶提取液0.2ml,4000lx日光下反應20min后于560nm測定其吸光度.SOD計算如式(5).

丙二醛(MDA)[14]含量的測定:1.5mL酶液中加入0.5%硫代巴比妥酸(TBA)溶液3mL,振蕩混合后于 100℃沸水浴上反應 30min,迅速冷卻后4000r/min離心 10min,上清液分別于 450,532, 600nm 波長下測定 OD 值.對照以 1.5mL 0.05mol/L pH 7.8的磷酸緩沖液代替酶液.MDA數量以umol/細胞數量表示.

MDA(μmol/L)=6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450

1.4 萘濃度的測定

取5mL藻液,過0.45μm孔徑的醋酸纖維濾膜,濾液用 Waters高效液相色譜儀.色譜柱為Inertsil ODS-3 5μm×2.1mm×250mm,進樣量為20μL,柱溫 40℃,流速為 0.4mL/min,流動相為乙腈:水=65:35(V:V),檢測波長 254nm,保留時間為6.856min.空白海水進樣測定萘濃度,結果表明采取的海水中萘濃度低于檢測限0.01×10-6.

1.5 數據處理與統計

利用 SPSS 18.0進行數據統計分析,包括平均值、標準差以及單因素方差分析(LSD比較),統計性顯著性假設為P<0.05.

2 結果與討論

2.1 萘對海洋三角褐指藻生長的影響及EC50

由圖1可見,與對照組相比,各萘濃度試驗組中藻細胞的生長均受到不同程度的抑制.在低濃度萘(初始濃度為 0.048,0.096,2mg/L)暴露下,海洋三角褐指藻的吸光度變化趨勢與對照組相近,受抑制作用不明顯.但當萘濃度達到8mg/L時,藻細胞受抑制程度隨著萘濃度的升高而增大.

由圖1數據計算得到不同濃度萘對海洋三角褐指藻的生長抑制率.結果表明,隨著萘濃度的增大,萘對海洋三角褐指藻的抑制率也不斷增大,抑制作用達90%以上的初始萘濃度為64mg/L.低濃度(初始濃度為0.048,0.096,2mg/L)萘暴露下,其最大抑制率僅為 17.19%,當萘初始濃度分別為8,16,32mg/L時,其最大抑制率達到 37.66%、55.40%和70.35%.同時,基本上所有濃度組抑制作用都在 48h時達到最大,然而隨著時間的繼續延長,抑制作用逐漸變小.這一方面可能與萘本身的強揮發性有關,另一方面也與藻類自身的恢復作用有關[9].萘的急性毒性效應在 48h時最為明顯.初始萘濃度64mg/L組除外,其抑制作用并沒有隨著時間的延長而減弱,可能是因為高濃度萘已經對海洋三角褐指藻造成了不可恢復的損傷作用.

圖1 不同濃度萘對海洋海洋三角褐指藻吸光度的影響Fig.1 Effects of various concentration of Naphthalene on the absorbance of Phaeodactylum tricomutum

經概率單位-濃度對數法計算各時間點萘對海洋三角褐指藻的半數有效量即EC50,如圖2所示,在24h時萘的EC50值最大,達到19.1849mg/L.原因可能是萘此時還沒有與海洋三角褐指藻充分接觸,毒性作用還不顯著.而在 48h時,萘的EC50值僅為0.9463mg/L,主要是因為萘自身的強揮發性以及萘對海洋三角褐指藻的急性毒性作用已經得到體現.這說明雖然萘自身的強揮發性會導致處理組中萘濃度不斷減少,但是監測短期(約48h)內高強度萘暴露下對海洋三角褐指藻在168h時的中長期毒性影響是非常有現實意義的.同時在 48h以后的各個時間點監測值總體呈減小趨勢,但值略有波動,說明在1周的慢性毒性作用過程中,雖然萘濃度由于強揮發性而不斷降低,但萘對海洋三角褐指藻的慢性毒性效應卻越來越顯著,并且在 168h EC50值最低,僅為0.2669mg/L,波動的原因可能是隨著時間的延長海洋三角褐指藻對萘漸漸產生了弱耐藥性.

圖2 萘的EC50變化趨勢Fig.2 The variation trend of EC50 of Naphthalene

圖3 萘對海洋三角褐指藻葉黃素和胡蘿卜素含量的影響Fig.3 Effects of Naphthalene on xanthophyll and carotene content of Phaeodactylum tricomutum

本實驗中,在萘暴露下,海洋微藻海洋三角褐指藻表現出較為明顯的濃度-效應相關性.當毒物濃度較低時(

2.2 萘對海洋三角褐指藻光合作用色素的影響

由圖3可見, 萘濃度小于2mg/L時,葉黃素和胡蘿卜素含量與對照組相比無顯著性差異,尤其是萘初始濃度為0.048, 0.096mg/L時,雖然這2個濃度組對海洋三角褐指藻生物量有抑制效應,是對葉黃素和胡蘿卜素產生輕度的刺激作用.當萘初始濃度達到8mg/L甚至更高時,海洋三角褐指藻的葉黃素和胡蘿卜素含量隨著萘濃度的增大而下降,當萘初始濃度為 64mg/L時,其含量在與萘接觸的 24h后即為0,海洋三角褐指藻的光合作用色素此時已遭到徹底破壞.

2.3 對SOD活性的影響和MDA含量的變化

由圖 4可知,在 168h時,初始萘濃度分別為0,0.048,0.096mg/L時,海洋三角褐指藻SOD活性并沒有顯著差異(P<0.05);萘初始濃度為2mg/L時,海洋三角褐指藻168h的SOD活性最強,并與其他處理組差異明顯(P<0.05),萘濃度為8mg/L時,SOD活性急劇下降,而當萘初始濃度達到 16, 32,64mg/L時, 168h-SOD活性降至接近0,且濃度間沒有顯著差異(P<0.05).可見,168h的SOD活性呈現出低萘初始濃度上升,高萘初始濃度時下降的趨勢.

圖4 168h時在萘暴露下海洋三角褐指藻SOD的活性Fig. 4 Effects of Naphthalene on SOD activity of Phaeodactylum tricomutum at 168h

丙二醛(MDA)含量的高低可以反映細胞膜脂過氧化的程度.如圖 5所示,在萘脅迫下,在0~8mg/L濃度范圍時,MDA含量變化不明顯,且各處理組海洋三角褐指藻 MDA含量并沒有顯著差異(P<0.05);而當萘初始濃度達到 16,32, 64mg/L時,海洋三角褐指藻的168h的MDA含量急劇增加,且各處理組間差異顯著(P<0.05),說明隨著萘初始濃度的不斷增加,其對海洋三角褐指藻的膜脂過氧化造成了不同程度的加劇,并導致細胞受到不同程度的損害.

圖5 168h時在萘暴露下海洋三角褐指藻MDA的含量Fig.5 Effects of Naphthalene on MDA content of Phaeodactylum tricomutum at 168h不同字母表示差異顯著

近幾年來,植物體內有效清除活性氧的保護機制得到了廣泛深入的研究,而其中 SOD、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)等作為植物體內清除活性氧、保護植物細胞免受傷害的保護性酶更是研究的重點[16-19].研究結果表明,植物體內在受到輕度的環境脅迫時,SOD活性會有所升高,以增強其對活性氧的清除能力;但是這些酶的含量和活性都在一定的毒物范圍內升高,當細胞受到重度逆境脅迫時它們的含量活性又會急劇下降,造成活性氧的積累和細胞的傷害[20].在本實驗中,對于SOD的研究也有類似的實驗結果.在萘的低濃度組(0.048~2mg/L)中, SOD活性受到明顯誘導,并隨著毒物濃度增大而升高,此時MDA作為膜脂過氧化物相應地有所降低;隨著毒物濃度的繼續增加,SOD受脅迫導致其合成或結構受破壞而引起活力下降,藻清除活性氧的能力亦下降,膜脂過氧化進一步加劇,超過了細胞的耐受極限時,膜脂過氧化帶來的損傷大于細胞自身的修復能力,SOD活性顯著下降并漸漸失活,自由基產生和消除之間的平衡被破壞,細胞開始受到毒害,海洋三角褐指藻生長也明顯受到抑制.SOD呈現低濃度誘導,高濃度抑制現象,即表現為“鐘形曲線”.這種現象在其他毒物的藻類實驗中也有類似的結果[21-23].

暴露在毒物下的生物體,一旦受到毒物脅迫,便自發的開始對這些毒物展開解毒過程[24].其細胞內外均會發生一系列的生理生化反應,原有的平衡被打破,新的平衡開始逐漸建立.這其中細胞內自由基含量以及MDA、SOD等含量的變化各有其特點和趨勢,在研究中找出其中的聯系對于揭示該類化合物對藻的毒性機制有重要作用.

2.4 萘濃度的同步變化

圖6 萘濃度隨時間的變化Fig.6 The changes of concentration of naphthalene with time with initial concentration of naphthalene at 0.048, 0.096, 2, 8,16,32,64mg/L, respectively

由圖6可見,萘的損失主要是由于自身的強揮發性,在 168h后,所有濃度組中萘的濃度均低于 0.5mg/L,即使是最大的萘濃度組,其濃度也只有0.3568mg/L.同時,在120h后0.048,0.096mg/L這 2個濃度組中的萘均已揮發至 0.并且,以DMSO作為助溶劑的萘在海水培養基中的溶解度依然很低,這7個濃度組的萘初始真實濃度由低到高分別僅有 0.0292,0.0431,0.9680,2.9281, 5.8809,12.2743,13.5793mg/L.

3 結論

3.1 隨著萘濃度的增大,其對海洋三角褐指藻生長的抑制較為明顯,該效應表現出一定的濃度和時間相關性.在0~168h內,低濃度組萘(初始濃度為 0~2mg/L)中葉黃素和胡蘿卜素含量與對照組相比無明顯差異.但當污染物初始濃度達到8mg/L甚至更大時,葉黃素和胡蘿卜素含量隨毒物濃度增加而迅速下降,呈現一定的濃度-效應關系.SOD活性變化隨毒物濃度升高,呈現先升高后下降的“鐘形曲線”.MDA的含量隨毒物濃度先略下降而后急劇上升.

3.2 在 0~168h內,萘濃度的損失主要是由于自身極強的揮發性.120h時,初始濃度為0.048mg/L和0.096mg/L 2個濃度組中萘濃度均揮發至0,且在 168h后,所有濃度組中萘的濃度均低于0.5mg/L.同時,以DMSO作為助溶劑的萘在海水培養基中的溶解度依然很低,最高濃度組萘的監測值也僅有13.5793mg/L.

[1] Karacik B, Okay O S, Henkelmann B, et al. Polycyclic aromatic hydrocarbons and effects on marine organisms in the Istanbul Strait [J]. Environment International, 2009,35:599-6064.

[2] Muddassir N, Faisal K, Paul A, et al. Subsea release of oil from a riser: an ecological risk assessment [J]. Risk Analysis, 2008, 28:1173-1196.

[3] 高亞輝.海洋微藻分類生態及生物活性物質研究 [J]. 廈門大學學報(自然科學版), 2001,40(2):566-573.

[4] Bate G C, Crafford S D. Inhibition of phytoplankton photosynthesis by the WSF of used lubricating oil [J]. Marine Pollution Bulletin, 1985,16(10):401-404.

[5] 李卓娜,孟范平,趙順順,等. BDE-47 對2種海洋微藻光合特性的影響 [J]. 中國環境科學, 2010,30(2):233-238.

[6] 李 燕,高亞輝,李雪松,等.海洋硅藻附著研究進展 [J]. 生命科學, 2008,5(20):768-772.

[7] Guillard R, Ryther J H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotellanana Hustedt and Detonuaconfervacea(Cleve) Gran [J]. Canadian Journal of Microbiology, 1962,8:229-239.

[8] Djomo J E, Dauta A, Ferrier V, et al. Toxic effects of some major polyaromatic hydrocarbons found in crude oil and aquatic sediments on Scenedesmus subspicatus [J]. Water Reasearch, 2004,38:1817-1821.

[9] Kong Q, Zhu L, Shen X. The toxicity of naphthalene to marine Chlorella vulgaris under different nutrient conditions [J]. Journal of Hazardous Materials, 2010,178:282–286.

[10] Debenest T, Pinelli E, Coste M, et al. Sensitivity of freshwater periphytic diatoms to agricultural herbicides [J]. Aquatic Toxicology, 2009,93:11-17.

[11] Sartory D P, Grobbelaar J U. Extraction of chlororphyll a from freshwater phytoplankton for spectrophtometric analysis [J]. Hydrobiologia, 1984,114:177-187.

[12] Wiley J Sons. Chlorophylls and carotenoids: measurement and characterization by UV-VIS specroscopy [J]. Current Protocols in Food Analytical Chemistry, 2001: F4.3.1-F4.3.8.

[13] 葉寶興,朱新產.生物科學基礎實驗 [M]. 北京:高等教育出版社, 2007:439-442.

[14] 郝再彬,蒼 晶,徐 仲.植物生理實驗 [M]. 哈爾濱: 哈爾濱工業大學出版社, 2004.

[15] Wang Y, Tang X, Li Y, et al. Stimulation effect of anthrancene on marine microalage growth [J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2002, 13(3):343-346.

[16] Gupta M, Sinha S, Chandra P. Copper-induced toxicity in aquatic macrophyte, Hydrilla verticillata: effect of Ph [J]. Ecotoxicology, 1996,5,23-33.

[17] Menone M L, Pesce S F. Endosulfan induces oxidative stress and changes on detoxication enzymes in the aquatic macrophyte Myriophyllum quitense [J]. Phytochemistry, 2008,69: 1150-1157.

[18] Sinha S, Gupta M. Oxidative stress induced by iron in Hydrilla verticillata(i.f.) role: response of antioxidants [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 1997,38:286-291.

[19] Gupta M, Tripathi R D. Role of glutathione and phytochemlatin in Hydrilla verticillata (i.f.) royle and vallisneria spiralis L under mercury stress [J]. Chemosphere, 1998,37:785-800.

[20] 唐學璽,李永祺.久效磷對海洋微藻毒性機理的初步研究 [J].環境科學學報, 1998,18(2):204-207.

[21] 聶湘平,鹿金雁,李 瀟,等. 蛋白核小球藻對叔丁基對羥基茴香醚的毒性響應 [J]. 暨南大學學報, 2007,28(5):513-517.

[22] 殷培杰,李培軍,劉 宛.氯苯甲酸植物毒性實驗中抗氧化酶變化的量化研究 [J]. 環境科學研究, 2005,15(5):21-25.

[23] 吳石金,俞 翔,吳爾苗,等.二氯甲烷和二氯乙烷對蛋白核小球藻的毒性影響研究 [J]. 環境科學, 2010,31(6):1655-1661.

[24] 周啟星,孔繁祥,朱 琳.生態毒理學 [M]. 北京:科學出版社, 2004.

Toxic effects of naphthalene on the growth of Phaeodactylum tricomutum and relevant biochemical indexes.

LI Yan-mei, ZENG Wen-lu, YU Qiang, ZHOU Qi-xing*(Key Laboratory of Pollution Processes and Environmental Criteria, Ministry of Education, Tianjin Key Laboratory of Environmental Remediation and Pollution Control, College of Environmental Science and Engineering, Nankai University, Tianjin 300071, China). China Environmental Science, 2012,32(1)：150~155

Phaeodactylum tricomutum was selected as target organism to study the toxicity of naphthalene under various concentration. From 0h to 168h, the optical absorbance, xanthophyll and carotene content had no obvious difference with blank control in low-concentration groups of naphthalene (0.048~2mg/L). However, when the concentration of naphthalene reached 8mg/L or more, dramatically decreases of the optical absorbance, xanthophyll and carotene content were gained. Activities of superoxide dismutase(SOD) increased at first and then decreased remarkably with the increasing concentration of naphthalene, showed as “Bell Shaped Curve”. And the content of malondialdehyde(MDA) decreased slightly and then flared up and lipid peroxidant aggregated with the increasing concentration of naphthalene.

water pollution；marine Phaeodactylum tricomutum；naphthalene；toxic effect

2011-03-23

國家自然科學基金資助項目(21077059,40930739);國家海洋局海洋溢油鑒別與損害評估技術重點實驗室2010年度開放基金項目(201008)

* 責任作者, 教授, zhouqx523@yahoo.com

X171.5

A

1000-6923(2012)01-0150-06

李艷梅(1987-)女,南開大學環境科學與工程學院碩士研究生,主要研究方向為生態毒理.發表論文4篇.