燃煤細顆粒物對血管內皮細胞EA.hy926的細胞毒性

劉芳盈,王菲菲 ,丁明玉,李 杰 (.淄博市疾病預防控制中心環境衛生監測所,山東 淄博 5506；.中國環境科學研究院環境基準與風險評估國家重點實驗室,北京 000；.山東大學公共衛生學院,山東 濟南 500)

燃煤細顆粒物對血管內皮細胞EA.hy926的細胞毒性

劉芳盈1,王菲菲2*,丁明玉2,李 杰3(1.淄博市疾病預防控制中心環境衛生監測所,山東 淄博 255026；2.中國環境科學研究院環境基準與風險評估國家重點實驗室,北京 100012；3.山東大學公共衛生學院,山東 濟南 250012)

以銀川散煤為樣品煤,在實驗室采用固定源稀釋通道采集燃煤 PM2.5,超聲波水浴提取燃煤 PM2.5全顆粒懸液,對人臍靜脈內皮細胞EA.hy926進行染毒,并采用MTS法檢測燃煤PM2.5在不同染毒時間對EA.hy926細胞增殖的影響.結果表明,燃煤PM2.5懸液對EA.hy926細胞分別染毒6,12,24h均可抑制細胞增殖,且12,24h各劑量組和溶劑對照相比具有統計學意義;在相同染毒劑量組內,和6,12h相比,染毒24h對細胞存活率抑制更加明顯,其差異具有統計學意義.可見,燃煤 PM2.5可以抑制血管內皮細胞增殖且具有時間和劑量依賴性,血管內皮損傷是PM2.5致心血管毒性的可能機制之一.

燃煤細顆粒物；PM2.5；血管內皮細胞；EA.hy926；細胞毒性；MTS法

目前,中國許多大中城市,PM2.5污染十分嚴重.據報道,2005年中國的總懸浮顆粒物(TSP)、可吸入顆粒物(PM10)和細顆粒物(PM2.5)的排放量分別是 29.98,15.30,9.79Mt,2000～2005年間的排放增長率分別是3.4%、4.7%和5.4%[1]. PM2.5主要來源于燃煤排放和汽車尾氣,目前我國的大氣污染雖然已從煤煙型大氣污染特征轉向煤煙和汽車尾氣復合型大氣污染特征,但仍以煤煙型污染為主[2-3].國家統計局發布的 2009年統計公報顯示,中國煤炭消費量為3.02Gt,遠遠高于歐盟和世界平均水平[4].直到2050年,煤炭占我國占一次能源消費比重仍會在 50%左右,主要利用方式為燃燒[5].燃煤排放的污染物以顆粒物為主,其中細顆粒物(PM2.5)貢獻較大.Dockery等[6]的研究結果顯示,空氣污染和心血管疾病死亡相關,并且細顆粒物空氣污染與心肺疾病的死亡增加顯著相關.Pope等[7]的研究結果表明,在控制各項混雜因素后,PM2.5年均濃度每增加10μg/m3,心血管疾病死亡率增加 8%,且死亡率與空氣動力學粒徑＞2.5μm的顆粒物相關關系不明顯.可見, PM2.5可能是與心血管疾病相關的主要環境污染物之一.

研究顯示,PM2.5可到達細支氣管及肺泡,通過肺部氧化應激炎癥反應釋放炎癥因子和細胞因子介導心血管事件,部分組分(如水溶性過渡金屬等)甚至可以穿過肺泡間質進入循環產生直接影響心血管系統[8-10].血管內皮細胞(VEC) 具有多種生理功能,血管內皮損傷是許多心血管疾病的病理基礎.人臍靜脈內皮細胞被廣泛用于內皮功能的研究中,但 HUVEC原代培養較為耗時,且易出現雜細胞的污染,傳2～3代后細胞就開始衰退,難以長期維持,對于多種來源顆粒物血管內皮細胞毒性比較研究中存在細胞數量和雜細胞干擾的限制. 因此,一般采用細胞株研究內皮功能.國內相關研究中有采用ECV304細胞進行顆粒物心血管毒性研究[11-13],但該株細胞已被證實為膀胱癌細胞派生來的上皮樣細胞而非血管內皮細胞[14-16].實驗選擇人臍靜脈內皮細胞株EA.hy926作為研究細胞,EA.hy926是人臍靜脈內皮細胞和A549融合的細胞株,是目前內皮功能體外研究中最為認可的細胞株[17].

細胞增殖毒性實驗常規選擇MTT法.MTT是一種四唑類化合物,自20世紀80年代出現并得到了廣泛應用.此法的主要原理是活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫結晶物formazan,并沉積在細胞中,而死細胞則無此功能[18].MTS是一種新合成的四唑類化合物,與MTT的應用原理相同. MTS被還原后生成的甲瓚產物顏色較深,還原產物穩定,且為水溶性物質,可直接測定,無需有機溶劑溶解[19].可見,在對多種樣品細胞毒性比較中,MTS試劑盒相比傳統MTT法具有方法簡便及檢測狀態穩定的特點,細胞毒性比較結果更為準確.實驗選擇銀川散煤為樣煤采集細顆粒物,以人臍靜脈內皮細胞EA.hy926為研究對象,采用MTS法檢測不同濃度燃煤PM2.5分別在染毒6,12,24h后對血管內皮細胞的毒性作用,為進一步探討燃煤PM2.5對心血管毒性機制奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞 人臍靜脈血管內皮細胞株EA.hy926購自美國ATCC細胞庫,增殖周期約為31h.

1.1.2 儀器 PM2.5撞擊式中流量顆粒物采樣器(78L/min),METTLER TOLEDO 分析天平(梅特勒-托利多儀器公司,AL104-IC),超聲震蕩儀(江蘇昆山市超聲儀器公司,舒美 KQ500DB),真空冷凍干燥機(北京亞泰科隆公司,LGJ-18),生物安全柜(美國 Thermo Forma公司),CO2恒溫培養箱(美國Thermo Forma公司),倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司,TH4-200),D-1型自動蒸汽滅菌鍋(北京發恩科貿有限公司),Model 680型酶標儀(美國 Bio-Rad 公司).

1.1.3 試劑 DMEM培養液(美國 HyClone公司),胎牛血清(美國 HyClone公司),磷酸鹽緩沖液 PBS(美國 HyClone 公司),雙抗青霉素-鏈霉素(華北制藥公司),胰蛋白酶(美國 Sigma公司),MTS試劑盒(美國Promega公司),石英纖維采樣濾膜(美國PALL公司).

1.2 方法

1.2.1 燃煤PM2.5的采樣 采樣時間為2009年11月,采樣地點在中國環境科學研究院氣溶膠實驗室,以銀川散煤為樣煤,采用 PM2.5撞擊式中流量顆粒物采樣器(78L/min)和直徑90mm的石英纖維濾膜,利用固定源稀釋通道對燃煤排放細顆粒物進行直接采集.采樣時,將銀川散煤塊加工到3～5cm,用焦炭引火,待火焰穩定后將采樣通道和燃煤爐連接.然后將已稱量好的煤塊均勻的放于爐內,同時開泵開始采樣,直到燃盡,記錄開始5min時采樣流量和結束前5min時采樣流量.石英纖維濾膜采樣前要在馬弗爐中 600℃灼燒 2h,恒溫干燥24h后稱重并用灼燒后的鋁箔包裝,采樣后用鋁箔紙包裝好并在同樣條件下平衡24h,-20℃避光保存.

1.2.2 燃煤 PM2.5的提取和染毒液配制 將載有燃煤 PM2.5的石英纖維濾膜,采樣面朝下置于50mL去離子水中,超聲震蕩 30min×2次(功率500W)以洗脫顆粒物.提取液8層紗布過濾,除去石英纖維濾膜碎片.將濾液分裝到已消毒小瓶中,5mL/瓶,真空冷凍干燥成干粉,稱重后用滅菌PBS配制成100,250,500,1000,2000μg/mL的顆粒物懸液作為染毒母液,于-20℃避光保存備用.

1.2.3 血管內皮細胞EAhy926的培養 將凍存的EA.hy926細胞移入于含20%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養液中,在37℃、5%CO2條件下培養復蘇.待細胞達到80%融合時,以0.25%胰酶消化,1:3傳代,用含 10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養液,在37℃、5%CO2條件下傳代培養至對數生長期.

1.2.4 細胞染毒和實驗分組 取處于對數生長期的生長良好的細胞,用含 10% 胎牛血清、1%雙抗的 DMEM 培養液將細胞濃度調整成3×105/mL細胞懸液,以每孔100μL接種于96孔板,在37℃、5%CO2條件下培養24h.將染毒母液超聲震蕩 15min,加入含 0.5% 胎牛血清的DMEM 培養液十倍稀釋[20],終濃度為 10,25,50, 100,200μg/mL,以 PBS為陰性對照.臨用前超生15min,棄去培養板中原培養液,加入已配制好的染毒液,每個劑量設置6個平行樣.

1.2.5 MTS毒性實驗[20]采用MTS法檢測細胞增殖毒性.細胞染毒結束前1h分別加入20μL/孔的MTS,將96孔板用鋁箔紙包好后置于37℃孵箱內繼續培養 1h,終止培養.用酶聯免疫檢測儀490 nm測吸光度OD(參考波長630 nm,檢測波長490nm).實驗重復2次后整理分析數據.按下列公式計算細胞存活率:細胞存活率(%)=OD實驗組/OD對照組×100%.

1.3 統計學分析

用SPSS 17.0軟件進行統計處理,實驗結果以均數±標準差表示.多個樣本均數的比較采用單因素方差分析,根據方差齊性檢驗結果,方差齊性時選擇LSD法,方差不齊時選擇Tamhane’s T2法.

2 結果

2.1 燃煤PM2.5對血管內皮細胞毒性的劑量-反應關系

由表1及圖1可見,燃煤PM2.5作用于EA. hy926細胞6h,在0～25μg/mL劑量范圍內可能存在低劑量興奮效應,輕微促進了細胞增殖(100%～103.71%),在 50～200μg/mL劑量范圍內出現了小幅度的抑制增值(99.92%～96.94%).但各劑量組與陰性對照組相比,差異均沒有統計學意義.

表1 不同染毒時間燃煤PM2.5對血管內皮細胞毒性的比較(n＝6)Table 1 Compared cytotoxicity of coal-fired PM2.5 on EA.hy926 cells exposed for different times(n＝6)

燃煤PM2.5作用于EA.hy926細胞12h,明顯抑制了細胞活性,且隨著染毒劑量的增加,細胞存活率下降越明顯(93.09%～87.88%),呈劑量-反應關系.與陰性對照組相比,50μg/mL(P＜0.05)、100μg/mL(P＜0.01)和 200μg/mL(P＜0.01)劑量組的差異均具有統計學意義.

燃煤PM2.5作用于EA.hy926細胞24h,細胞活性抑制程度明顯,且隨著染毒劑量的增加,細胞存活率下降更加明顯(93.39%～78.04%),呈劑量-反應關系.各劑量組與陰性對照組相比,差異均具有統計學意義(P＜0.01).

圖1 燃煤PM2.5對EA.hy926細胞毒性的劑量-反應曲線Fig.1 Dose-effect curve of cytotoxicity of coal-fired PM2.5 on EA.hy926 cells

2.2 燃煤 PM2.5對血管內皮細胞毒性的時間依賴性關系

如表 1所示,在同一染毒劑量組內,10μg/mL劑量組在6,12,24h對EA.hy926細胞活性的差別無統計學意義;25,50μg/mL劑量組和染毒12h相比,染毒6h對EA.hy926細胞活性的差別有統計學意義(P＜0.01或 P＜0.05),而染毒 24h對 EA. hy926細胞活性的差別無統計學意義;100, 200μg/mL劑量組在不同染毒時間組細胞存活率結果的差異均有顯著意義(P＜0.01或P＜0.05).

可見,燃煤PM2.5作用于EA.hy926細胞,相同染毒時間時,隨著染毒劑量的增加,細胞活性抑制程度越高,具有劑量-反應關系;相同染毒劑量時,隨著染毒時間的增加,細胞活性抑制程度越高,具有時間依賴性關系關系.綜上所述,染毒劑量越大,染毒時間越長,燃煤PM2.5對EA.hy926細胞活性抑制越明顯,存在時間依賴和劑量依賴關系.

3 討論

近年來的一些研究發現,PM2.5對心血管系統的毒作用可能是其人群健康危害的主要原因,顆粒物引起的心臟病死亡遠高于呼吸系統的死亡[8,21-23].美國ANA于2011年綜述100多項研究結果顯示PM2.5急性或慢性暴露每增加10μg/m3,心血管疾病死亡危險會顯著增加(慢性相對危險度:1.06～1.76).其中,缺血性心臟病、心率失常、心力衰竭和心臟驟停占主要部分;健康效應機制主要包括肺部炎性反應、動脈粥樣硬化加速及自主神經功能紊亂[24].而動脈粥樣硬化(AS)是心血管系統疾病中最常見的疾病,也是眾多心腦血管疾病共同的病理基礎.現在血管內皮的損傷幾乎被公認為是 AS發生的始動環節,血管內皮損傷引發血栓形成是許多心血管病的病理基礎.PM誘導的炎癥可以作用于血管內皮細胞, 導致內皮功能障礙,從而加速AS進展,可能是顆粒物污染和心血管死亡之間關系的基礎[25].

目前PM2.5對血管內皮細胞毒理學研究尚不多,對血管內皮細胞時間依賴性的研究更為少見.但已有結果均表現出PM2.5對血管內皮細胞毒性存在劑量和時間依賴性.Zhao等[26]將大氣 PM2.5水溶及有機組分暴露于 HUVECs 24h,結果顯示水溶及有機組分均抑制了細胞生長且水溶組分抑制作用更強,并具有劑量反應關系.Han等[27]研究發現,大氣PM2.5懸浮液、水溶組分和水不溶組分暴露于EA.hy926細胞24h后,分別抑制了細胞增殖且存在劑量-反應關系.Mo等[28]研究顯示,大鼠肺動脈微血管內皮細胞(MPMVEC)暴露于UFP 12,24,36,48,72h后,12h沒有明顯的毒性,但從 24h開始均顯示了明顯的細胞毒性且存在時間反應關系.本研究結果顯示染毒 6h對 EA. hy926細胞無明顯毒性,但在12h、24h均顯示出明顯的細胞毒性,并具有時間依賴性.兩項研究中出現明顯細胞毒性的時間略有差異的原因可能是因為燃煤PM2.5富集了更多的過渡金屬和有機成分,更易誘導過氧化損傷[29],介導血管內皮損傷.鄭燦軍等[30]采用原代培養的大鼠心肌細胞,以細胞存活率為指標,觀察到PM 及其組分對心肌細胞的hormesis效應,即低劑量刺激(低濃度時細胞活力隨劑量的增加而上升),而高劑量時抑制心肌細胞的活力(高濃度時,細胞活力隨劑量增加而降低).本研究中銀川燃煤 PM2.5作用于EA.hy926細胞6h后,在10和25μg/mL 2個劑量組觀察到輕微促進增殖作用,但均無統計學差異;且染毒 12,24h,燃煤 PM2.5的作用均表現為抑制增殖.燃煤 PM2.5對血管內皮細胞是否存在hormesis效應,仍需進一步探索研究.

顆粒物是一種復雜混合物體,不同來源的顆粒物由于形成條件和化學組分不同,其對健康的影響性質和程度也不相同.銀川市采暖期 PM2.5中各種無機離子和重金屬元素(Fe、Zn、Cd、Pb等)高度富集,顯著高于非采暖期,說明冬季燃煤對重金屬元素貢獻明顯[31].Ni、Zn、Pb、Co、Fe、As、Cd、Cr等嚴重危害人體健康的有害重金屬元素高度富集在 PM2.5上[31].研究表明,燃煤顆粒物中富含Fe等金屬元素,可誘導豚鼠肺泡巨噬細胞產生活性氧自由基,引起脂質過氧化損傷[29,32].目前大氣顆粒物對心血管健康效應的研究剛剛開展,燃煤源顆粒物成分更為復雜,有害元素及成分高度富集,但燃煤源顆粒物心血管健康效應研究尚處起步,其健康效應毒性機制尚待探討.本研究在體外培養血管內皮細胞的基礎上,觀察了不同染毒劑量和時間燃煤 PM2.5對血管內皮細胞EA.hy926的毒性作用,結果顯示隨著染毒劑量增大,燃煤PM2.5可抑制EA.hy926細胞增殖,具有劑量-反應關系;且染毒時間越長,細胞存活率顯著降低.這初步顯示燃煤 PM2.5可引起血管內皮損傷,其損傷機制仍需進一步探索.

4 結論

4.1 燃煤PM2.5染毒EA.hy926不同時間后均對EA.hy926細胞活性產生抑制且存在劑量-反應關系.

4.2 相同劑量組比較, 燃煤 PM2.5對 EA.hy926細胞活性存在時間依賴關系,即染毒時間越長,細胞活性抑制越明顯.

4.3 血管內皮損傷可能是燃煤 PM2.5致心血管毒性機制之一,但仍需深入探討.

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Cytotoxicity assessment of fine particles from coal combustion on EA. hy926 vascular endothelial cells.

LIU Fang-ying1, WANG Fei-fei2*, DING Ming-yu2, LI Jie3(1.Zibo Municipal Center For Disease Control and Prevention, Zibo 255026, China；2.State Key Laboratory of Environmental Criteria and Risk Assessment, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China；3.School of Public Health, Shandong University, Jinan 250012, China). China Environmental Science, 2012,32(1)：156～161

The coal sample taken from Yinchuan, coal-fired PM2.5was sampled by fixed source dilution channel and PM2.5suspension was extracted by ultrasonic water-bath method. Human umbilical vein endothelial cells were treated with PM2.5suspension at various concentrations and exposed for different times (6h, 12h, and 24h). The MTS assay was used to measure the effect of PM2.5on cell proliferation of EA. hy926. Coal-fired PM2.5suspension decreased the viability of vascular endothelial cells at different times and exposure time groups of 12h and 24h showed significance statistically in comparison to the solvent control. Compared with the same concentration group of 12h and 6h, exposure time groups of 24h had statistically significant differences. Coal-fired PM2.5could significantly decrease the viability of hman umbilical vein endothelial cells in dose-dependent and time-dependent manner. Vascular endothelial injury might be one of the possible mechanisms of cardiovascular toxicity caused by coal-fired PM2.5.

coal fine particles；PM2.5；vascular endothelial cell；EA.hy926；cytotoxicity；MTS assay

2011-03-21

中國環境科學研究院中央級公益性科研院所基本科研業務專項(2009KYYW05)

* 責任作者, 助理研究員, wangff@craes.org.cn

X111.5

A

1000-6923(2012)01-0156-06

劉芳盈(1984-),男,山東東營人,碩士,研究方向為環境毒理學.發表論文2篇.