尿酸分子印跡電化學傳感器的研制及其應用

殷靜芬，連惠婷，孫向英，劉斌

（華僑大學 材料科學與工程學院，福建 廈門 361021）

尿酸分子印跡電化學傳感器的研制及其應用

殷靜芬，連惠婷，孫向英，劉斌

（華僑大學 材料科學與工程學院，福建 廈門 361021）

以殼聚糖為功能基體，尿酸為模板分子，利用恒電位沉積法制備對血清中尿酸具有高度選擇性的分子印跡電化學傳感器.以衰減全反射紅外光譜（FTIR－ATR）和電化學交流阻抗法（EIS）等方法表征印跡膜的形成，并應用伏安技術研究該傳感器的電化學行為.研究結果表明：在0.1mol·L－1（pH＝5.0）的磷酸鹽（PBS）緩沖溶液中，尿酸在該印跡傳感器上具有良好的電化學響應，氧化峰電流與尿酸的濃度在0.1～80.0μmol·L－1之間呈良好的線性關系，相關系數為0.999 1.所制備的傳感器具有良好的選擇性，穩定性和重現性，將該傳感器應用于實際樣品中尿酸的分析檢測，方法回收率在97.41%～102.8%之間.

尿酸；電化學傳感器；殼聚糖；分子印跡

尿酸（UA）是人體內嘌呤代謝的終產物，人體血液中尿酸含量過高是許多疾病的征兆，如心血管疾病、痛風、肥胖、糖尿病、高膽固醇、高血壓、腎病、心臟病等［1］.因此，研究尿酸的檢測方法在藥物控制、臨床醫學診斷，以及實現對生物分子的在線測定等方面具有重大意義.目前，檢測尿酸的方法主要有熒光法、色譜法、酶方法、電化學、同位素稀釋質譜法（ID／MS）和毛細管電泳法等［2-7］.在上述各種方法中，電化學法由于具有即時檢測和在線分析的優點，且檢測前不用對樣品進行前處理，在尿酸檢測中被廣泛應用.檢測尿酸最好的電化學方法是酶法，但是應用該方法成本較高，而且酶的穩定性較低.因此，發展一種不需要酶催化而又有較好選擇性的電化學傳感器來檢測尿酸成為研究熱點.分子印跡傳感器技術是高選擇性的分子印跡技術與高靈敏度的傳感器技術的有機結合，且檢測過程中不需要酶的加入，制備簡單、造價低廉，具有較好的穩定性.分子結構中具有許多活性基團，如氨基和羥基可以在不同的介質中與目標分子通過靜電或氫鍵相互作用［8］，而且在負電位下可以被電沉積至基體表面［9-10］.基于此，本文制備了尿酸分子印跡電化學傳感器來實現對尿酸的高選擇性檢測.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI440A電化學工作站（上海辰華儀器公司），采用三電極系統：玻碳電極（直徑為3mm）為工作電極、飽和甘汞電極（SCE）為參比電極、自制鉑絲電極為對電極；NIGOLET－Nexus470傅里葉變換紅外光譜儀（美國Thermo Nicolet公司）；PARSTAT2273型高級電化學工作站（美國Princeton Applied Research公司）.

殼聚糖（CTS，美國Sigma公司，脫乙酰度≥90%）；尿酸，咖啡因，抗壞血酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；尿素（分析純，浙江寧波市化學試劑廠）；多巴胺（Acros Organics，純度為99%）.實驗中其他所用試劑均為分析純.CTS儲備液：準確稱取0.25g的CTS，用0.1mol·L－1HCl溶解，然后用0.1mol·L－1NaOH溶液調至pH＝5.0，配制成5.0g·L－1的CTS儲備液.沉積液：含有1.0mmol·L－1尿酸分子的CTS儲備液.

1.2 尿酸分子印跡電化學傳感器的制備

將玻碳電極（GCE）分別在5＃，6＃金相砂紙上拋光成鏡面，用二次水沖洗干凈；然后，依次在體積比為1∶1的HNO3，二次水中各超聲清洗5min.將處理好的電極作為工作電極，置于沉積液中，在－1.1 V（Vs.SCE，下同）下恒電位沉積3min，使模板分子與殼聚糖同時沉積至玻碳電極表面.取出，用水淋洗后，晾干，則制得CTS／UA聚合膜修飾電極.將膜電極在0.01mol·L－1的KCl和乙醇溶液中恒電位處理20min，以洗脫模板分子，再用水淋洗、晾干，則制成保留有尿酸分子空穴的印跡傳感器.

非印跡電極的制備.除不含模板分子外，其他條件同印跡電極的制備過程.

1.3 實驗方法

室溫下，在0～0.70V之間用循環伏安（CV）法、微分脈沖伏安（DPV）法優化實驗條件和檢測傳感器的性能.循環伏安法的掃描速率為0.1V·s－1；微分脈沖伏安法的脈沖幅度為0.05V，脈沖周期為0.02s，脈沖寬度為0.05s.用0.1mol·L－1PBS（pH＝5.0）緩沖溶液為底液檢測尿酸，在優化實驗數據之前，把尿酸分子印跡電極浸于2.0×10－5mol·L－1UA溶液中10min以使其重新結合尿酸分子.

電化學阻抗譜（EIS）實驗在含有0.01mol·L－1［Fe（CN）6］3-／4－ 電化學探針的電解質溶液（0.1 mol·L－1的KCl）中，使用Zview軟件擬合所采集的數據，并模擬出實驗制備的傳感器的等效電路圖.

2 結果與討論

2.1 膜電極的電化學響應

在電位為0～0.70V內，UA／CTS膜（曲線1）和CTS膜（曲線2）修飾電極在PBS溶液中的循環伏安（CV）圖，如圖1所示.圖1中的插圖是修飾電極在PBS溶液中的微分脈沖伏安（DPV）掃描曲線.由圖1的曲線1可知，循環伏安掃描過程中，僅在0.36V附近有一個明顯的氧化峰；與曲線2相比較，可知該電位為尿酸在電極上的氧化峰電位，且其電化學過程為不可逆.

UA在裸玻碳上的氧化峰電位在0.54V，在殼聚糖多壁碳納米修飾電極上的則為0.44V［5］.從圖1的插圖可以明顯看出，印跡膜電極在此電位范圍內有尿酸的氧化峰存在，而非印跡的則沒有，說明尿酸和殼聚糖在恒電位條件下已經共沉積至玻碳電極表面.同時，對于印跡傳感器的制備過程和性能表征等可通過模板分子的特征峰峰電流來反映.

圖1 膜電極在PBS中的CV圖Fig.1 Cyclic voltammograms of membrane electrode in PBS

2.2 傳感器制備條件的優化及表征

2.2.1 沉積時間的選擇 印跡膜的厚度影響著模板分子結合位點的數量，進而影響到印跡傳感器的靈敏度，而電沉積方法所形成的膜厚度是由沉積時間控制的.改變電沉積的時間（tE），觀察尿酸在印跡電極上的氧化峰電流變化趨勢，結果如圖2所示.

從圖2中可以看出，在1～3min內，氧化峰電流隨沉積時間的增長而增大，超過3min后，氧化峰電流有略微的降低.這是因為電沉積時間較短時，沉積膜薄，與CTS形成復合物并沉積至電極表面的尿酸較少，峰電流較低；隨著電沉積時間的增長，沉積膜加厚，膜內結合的尿酸分子數量也增多，形成的尿酸結合位點也相應增加，因而氧化峰電流增大.但電沉積時間太長時，雖然印跡膜內的尿酸分子含量相對較多，但是膜太厚會阻礙尿酸分子進出膜中心的結合位點，影響尿酸的完全洗脫和充分的再結合.同時，尿酸在膜中的傳質過程也受到阻礙，降低了尿酸的電化學響應速率，從而降低尿酸在印跡膜傳感器上響應的靈敏度.因此，選擇電沉積時間為3min.

2.2.2 洗脫時間及洗脫電位的選擇 沉積膜中模板分子是否洗脫完全將影響印跡傳感器的靈敏度和選擇性，對于具有電活性的物質來說，洗脫程度可通過其峰電流的降低程度來反映.以0.01mol·L－1的 KCl和無水乙醇作為洗脫劑，采用恒電位洗脫法，分別于0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6V 下洗脫一定時間，發現當洗脫電位為0.4V時，洗脫效果最好.

固定洗脫電位為0.4V，考察不同洗脫時間（tW）對尿酸氧化峰電流的影響，如圖3所示.從圖3可以發現，當洗脫時間為5min時，尿酸的氧化峰電流有明顯降低，繼續洗脫至20min時已檢測不到尿酸的氧化峰電流，所以選擇洗脫時間為20min.

圖2 沉積時間對峰電流的影響Fig.2 Effects of electrodeposition time on peak current

圖3 洗脫時間對峰電流的影響Fig.3 Effects of washing time on peak current

2.3 分子印跡電化學傳感器的表征

2.3.1 電化學交流阻抗譜表征 電化學交流阻抗譜（EIS）可以反映電極的界面動力學過程.在頻率為0.1～100kHz范圍內，膜電極的交流阻抗譜如圖4所示.圖4中：內插圖為擬合所用的等效電路圖.從圖4可知，曲線1幾乎為一條直線，說明這一過程電子轉移較快，電化學過程主要受擴散控制；而曲線2，3，4在高頻區為半圓部分，低頻區為直線部分，這可歸因于電極表面的修飾膜阻礙界面電子的傳遞.

從圖4還可知，印跡電極的阻抗（303.6Ω）要明顯小于非印跡電極（477.3Ω）和聚合物修飾膜電極的阻抗（436.8Ω）.這可能是因為印跡電極膜內存在大量的UA印跡空穴，使Fe（CN）3－6／Fe（CN）4－6探針分子擴散速率提高而有利于電解質和電極界面的電子轉移.各電極的EIS變化表明了UA／CTS聚合物可以很好地沉積至GCE表面，并進一步形成具有一定印跡空穴的分子印跡膜.

2.3.2 衰減全反射紅外表征 為了更進一步的證實UA／CTS聚合物膜已經電沉積至玻碳電極表面，用衰減全反射紅外表征（ATR－FITR）對其進行表征，如圖5所示.圖5中：T為透射率.從圖5可看出，在兩條曲線的800～900cm－1處均有一強而寬的吸收譜帶，這是β－糖苷鍵的特征峰.在兩條曲線中分別位于1 079，1 160和1 500cm－1處的吸收譜帶可以歸為殼聚糖的下列振動：C6－OH不對稱振動，C3－OH拉伸振動和－NH2的彎曲振動.

UA／CTS膜的曲線在1 600cm－1有一個新的譜帶出現，這是尿酸中CO基的吸收譜帶，而另一個新的，出現在3 000cm－1的寬譜帶是由尿酸中的OH，NH，C－NH 和CH一般振動引起的［11］.從ATR－FITR中的光譜數據可以看出，尿酸和殼聚糖已經共沉積至玻碳電極的表面.

圖4 膜電極的交流阻抗譜Fig.4 EIS of different electrodes

圖5 膜電極的衰減全反射紅外表征光譜 Fig.5 FTIR－ATR spectra of modified membranes

2.3.3 印跡傳感器的選擇性 通過計算尿酸氧化峰電流的比率（I／I0）來反映印跡電極對尿酸的選擇性，其中I和I0分別表示有干擾物和沒有干擾物存在時印跡電極所檢測到的尿酸氧化峰電流值.為了考察分子印跡傳感器對結構相似物的選擇性，研究與尿酸結構相似的物質——咖啡因存在下，印跡電極對尿酸的選擇性檢測情況.實驗發現，當加入咖啡因的濃度是尿酸濃度的10倍時，I／I0的值僅降低了1.38%，但是當加入咖啡因的濃度增加到100倍時，I／I0有明顯的降低.這可能是因為咖啡因與尿酸的結構比較相似，在濃度過高的情況下與尿酸發生了競爭吸附，占據了尿酸的印跡位點，導致印跡膜對尿酸的吸附量減少.

以20.0μmol·L－1的UA的氧化峰電流值為對照值，考察抗壞血酸、尿素、肌氨酸酐和多巴胺等在人體血清中與尿酸共存的物質對尿酸檢測的干擾情況，如圖6所示.圖6中：數字標注分別表示加入干擾物質的濃度是UA的多少倍.從圖6可知，當抗壞血酸、尿酸、肌氨酸酐和多巴胺的濃度分別是尿酸濃度的100倍，100倍，50倍和1倍時，I／I0的值基本上沒有變化，直到加入量分別是尿酸的200倍，500倍，100倍和10倍時I／I0才會有一點降低.實驗結果表明，印跡傳感器這些干擾物質存在下，對尿酸具有良好的選擇性.

2.3.4 尿酸分子印跡傳感器的吸附動力學 對模板分子的富集通常是增強印跡傳感器選擇性的簡單而有效的方式［12］.尿酸分子印跡傳感器的吸附動力學曲線，如圖7所示.從圖7可知，尿酸的氧化峰電流隨著吸附時間的增長，ipa迅速增大，當吸附時間為10 min時達到吸附平衡.這是因為在開始吸附時，UA分子很容易到達印跡膜上的位點，結合速率很快；但是，隨著吸附時間的增長，印跡膜上的位點逐漸被UA分子占據，吸附10min時，印跡膜上的UA位點已基本結合完全，10min后吸附量不再增加，吸附到達平衡.

印跡電極洗脫前和吸附后與尿酸的結合量可以根據下式計算，即

圖6 干擾物質對印跡電極檢測的影響Fig.6 Effects of interfering substances on detection of imprinted electrode

上式中：n為得失電子數；F為法拉第常數；Γ為吸附量；A為電極面積；v為掃描速率；R為氣體常數；T為絕對溫度.根據上式可求出在pH＝5.0時，印跡電極洗脫前的Γ值為111.9μnmol·m－2，吸附10 min后的Γ值為104.4μmol·m－2.印跡電極洗脫前和吸附后的吸附量基本相同，說明UA分子可以很好地地占據印跡膜的空穴，從而實現對UA的選擇性檢測.

2.3.5 分子印跡和非印跡傳感器的吸附熱力學 殼聚糖是甲殼素脫乙酰化的衍生物，有許多活性基團如羥基和氨基，這些基團與一些官能團能進行很好的反應［13-14］.當用殼聚糖作為功能基體時，尿酸所具有的氨基和羥基與殼聚糖的氨基和羥基間會形成強的氫鍵［5］，從而更有利于印跡聚合物的形成.吸附曲線能夠用Langmuir模型進行擬合，如圖8所示.其平衡數據可用Langmuir等溫線進行分析，計算式為

上式中：qm為飽和吸附量；Kb為結合常數.

圖7 尿酸分子印跡傳感器的吸附動力學曲線Fig.7 Adsorption dynamics curve of UA molecularly imprinted sensor

圖8 尿酸印跡電極吸附等溫線的Langmuir模型擬合 Fig.8 Adsorption isotherms fitted with Langmuir model

從圖8中可看出，分子印跡傳感器的吸附容量明顯高于非印跡傳感器，印跡傳感器和非印跡傳感器的最大氧化峰電流分別是222.7，25.02μA，分子印跡效率為8.90，以此作為判斷印跡傳感器和非印跡傳感器對尿酸最大吸附容量比率的依據［15］.這一數據表明，印跡傳感器具有更好的識別尿酸的能力.

2.3.6 線性范圍和檢出限 在最佳條件下，對不同濃度的UA進行微分脈沖伏安法測定，結果如圖9所示.圖9中的插圖是線性曲線圖.從圖9可知，UA的氧化峰電流與其濃度在0.1～80.0μmol·L－1范圍內呈良好的線性關系，線性回歸方程Ip＝1.099 1c－0.259 6，R2＝0.999 0，定量檢出下限為0.1 μmol·L－1.

2.3.7 印跡傳感器的重現性和穩定性 為了考察印跡傳感器的重現性，將印跡電極在20.0μmol·L－1的UA溶液中吸附10min后測定其氧化峰電流值；然后，在體積比為1∶9的0.01mol·L－1的KCl／乙醇混合溶液中用0.4V電位進行洗脫，重復測定10次，相對標準偏差為1.91%.同時，印跡電極在連續使用一周后對尿酸的電化學響應降為原來的89%.以上實驗結果表明，所制備的印跡傳感器具有良好的重現性和穩定性，可以滿足實際樣品測定的需要.

圖9 印跡傳感器對不同濃度UA的DPV響應Fig.9 DPV Responses of MIP electrode to different concentrations of UA

2.4 實際樣品的檢測

取人體血清樣品3份，所有用于檢測的樣品均是原始血清（來自于華僑大學校醫院），用0.1mol·L－1的PBS稀釋10倍.每個樣品用微分脈沖伏安法平行測定3次，利用標準加入法測定方法的回收率，結果如表1所示.表1中：CD，CA，CR分別為尿酸的檢測值、加入值和回收值；η為回收率.從表1可以看出，該印跡傳感器對血清樣品中尿酸檢測的結果令人滿意.

表1 人體血清樣品中尿酸標樣的回收率測定Tab.1 Determination of recovery rates of UA in serum samples

3 結束語

基于殼聚糖的電沉積，制備了以殼聚糖為功能基體的尿酸分子印跡電化學傳感器.所制備的分子印跡傳感器對尿酸具有特異性識別能力，相對于非印跡傳感器的印跡效率達8.9，且對常見共存物質具有較好的抗干擾性.尿酸在傳感器上的氧化峰電流與尿酸濃度在一定范圍內成良好的線性關系，定量檢測下限為0.1μmol·L－1.將該傳感器應用與于人體血清中尿酸的檢測，獲得了滿意的結果，可為檢測生物樣品中的尿酸提供了一個快速和可靠的方式.

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Highly Selective Determination of Uric Acid in Human Serum by Molecularly Imprinted Electrochemical Sensor

YIN Jing－fen，LIAN Hui－ting，SUN Xiang－ying，LIU Bin

（College of Material Science and Engineering，Huaqiao University，Xiamen 361021，China）

A highly selective molecularly imprinted electrochemical sensor of uric acid（UA）was prepared with chitosan（CS）as functional matrix and uric acid as template molecule via constant potential electrochemical deposition.The imprinted membrane was characterized by Attenuated total reflection infrared spectroscopy（ATR－FTIR）and Electrochemical impedance spectroscopy（EIS）；the performances of the sensor were studied by cyclic voltammetry（CV）and differential pulse voltammetry（DPV）.The UA had good electrochemical response in 0.1mol·L－1phosphate buffer solution（PBS）（pH＝5.0）.The oxidation peak current of DPV was well－proportional to the concentration of UA in the range from 0.1 μmol·L－1to 80.0μmol·L－1，with a correlation coefficient of 0.999 1.The developed sensor exhibited specific recognition for UA against the competitors which consisted of similar structure and coexisting interference in human serum.Moreover，the sensor also shows exellent reproducibility and was successfully employed to the determination of UA in human serum with the recovery of 97.41%～102.8%.

uric acid；electrochemical sensor；chitosan；molecularly imprinted

黃曉楠 英文審校：陳國華）

O 657.1

A

1000－5013（2012）01－0033－06

2011－10－11

劉斌（1963－），男，教授，主要從事電化學分析與檢測的研究.E－mail：bliu＠hqu.edu.cn.

國家自然科學基金資助項目（20955001，21175049）；福建省自然科學基金計劃資助項目（D0710017，D0810016，2011J01049）；教育部留學回國人員科研啟動基金資助項目（2008年度）；國務院僑辦科研基金資助項目（10QZR13）