對嗜壓蛋白氨基酸壓力不對稱指數的修訂

張光亞

（華僑大學 化工學院，福建 廈門 361021）

對嗜壓蛋白氨基酸壓力不對稱指數的修訂

張光亞

（華僑大學 化工學院，福建 廈門 361021）

選取嗜壓菌最多的4種希瓦氏菌屬（Shewanella）微生物共計473對同源蛋白，統計了21 662個氨基酸突變位點，在此基礎上計算氨基酸壓力不對稱指數（PAI），并將其同氨基酸70種理化性質進行相關性分析.結果表明：色氨酸和異亮氨酸的嗜壓性能最強，而脯氨酸、甘氨酸和天冬酰胺的嗜壓性能最弱，這與之前的報道存在較大差異.此外，70種氨基酸理化性質中有13種同PAI存在較強的相關性，其中僅有氨基酸的無規則傾向因子同PAI呈負相關，表明高的PAI值不易形成卷曲.由于展示的PAI值更適合于處于低溫環境下的嗜壓微生物，因此對以前的PAI值進行了修正.

嗜壓微生物；壓力不對稱指數；氨基酸；傾向因子；適壓機制

對多數海洋微生物尤其是深海微生物而言，在高壓下生存尤為重要，相比于其他極端微生物，人們對嗜壓微生物的關注較少［1］.同溫度一樣，壓力也是嚴重影響生物體內分子體系的熱動力學參數，但壓力對生物分子的影響一直沒有得到應有的重視［2］.近年來研究發現，一些蛋白質（或者酶）在高壓條件下表現出良好的特性，如在最適溫度下，生物分子的催化能力明顯上升，酶活力提高了約25%，或者其催化底物的特異性發生改變［3-4］.基因組學和蛋白質組學的迅猛發展，為了解嗜壓微生物內生物分子體系提供了全新的視角.通過對一些已完成基因組測序的嗜壓微生物基因組或蛋白質組的分析表明，它們在膜蛋白、呼吸鏈、DNA損傷修復、核糖體結構及組裝等方面都存在明顯特點［5］.然而，有關嗜壓蛋白質中氨基酸使用的偏好與其理化性質之間聯系的研究很少，但在嗜熱［6］、嗜冷［7］等極端蛋白質中卻得到廣泛研究.Di Giulio首次利用蛋白質組信息，系統比較了Pyrococcus嗜壓和非嗜壓微生物的141個直系同源序列（orthologs），結果發現側鏈較小精氨酸（Arg），甘氨酸（Gly），纈氨酸（Val）和天冬氨酸（Asp）在嗜壓蛋白質中含量很高，而一些側鏈較大的氨基酸如酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）則含量很低.在此基礎上，他提出了氨基酸壓力不對稱指數（pressure asymmetry index，PAI），即PAI與氨基酸分子量呈反比，而同其極性呈正比［8］.然而，文獻［9－10］的研究中卻發現，嗜壓蛋白中嗜壓氨基酸并不一定含量更高，相反非嗜壓氨基酸則明顯上升.本文從Shewanella兩對嗜壓和非嗜壓微生物中得到了473對同源蛋白，共統計了185 621個氨基酸，計算其氨基酸壓力不對稱指數，發現與Di Giulio的結果存在較大差異，并將其同氨基酸的70種理化性質進行了相關性分析，找出了與壓力顯著相關的氨基酸理化特性.

1 材料和方法

1.1 微生物的選取

目前發現的嗜壓微生物多為細菌，且同時也為嗜冷菌，Shewanella是目前分布于深海中最廣泛的嗜壓微生物［11］.因此，共選取了Shewanella兩對微生物全蛋白質組序列，它們分別為：S.benthica KT99和S.frigidimarina NCMIB400，以及S.violacea DSS12和S.sediminis HAW－EB3，前者均為嗜壓微生物，后者為均非嗜壓［12－13］.

S.benthica KT99為專性嗜壓菌，分離自海平面下9 856m深處，其最適生長溫度和壓力分別為10℃和50MPa，基因組G＋C的摩爾分數為46%；S.violacea DSS12分離自海平面下5 110m深處，最適生長溫度和壓力分別為8℃和30MPa，基因組G＋C的摩爾分數為44.7%；S.frigidimarina NCMIB400為革蘭氏陰性菌，最適生長溫度為10℃，基因組G＋C的摩爾分數為41.6%，S.sediminis HAW－EB3為兼性厭氧菌，最適生長溫度為10℃，基因組G＋C的摩爾分數為46.1%.這4種微生物來源于同一個屬，親緣關系較近；其最適生長溫度接近，基因組G＋C的摩爾分數也很接近，從而最大程度的降低了其他因素對同源蛋白氨基酸選擇的影響，使生長壓力成為影響氨基酸使用偏好的最重要因素.

1.2 同源序列的獲取及序列比對

以上4種微生物全蛋白質組序列來源于 UniProtKB（http：／／www.uniprot.org／）［14］.為了減少信息冗余，剔除了所有長度小于100個氨基酸的序列，因為它們大多為片斷（fragment）或者部分（partial）.采用BlastP程序［15］選取直系同源序列（orthologs），其E 值為1.0×10－10，并找出90%長度覆蓋范圍內，同一性（identity）大于30%的同源蛋白序列.樣本1包含222對同源序列，樣本2包含251對，共計473對，946條.該樣本量足夠用于探測嗜壓蛋白在氨基酸使用上的某種趨勢.

獲得同源序列后，采用Clustal X軟件［16］將473對同源蛋白兩兩進行比對［8］，以統計同源蛋白在某些位點氨基酸發生突變的情況.

1.3 壓力不對稱指數的計算

在正常情況下，兩種氨基酸發生互相突變的幾率應該是50∶50的比例，即各占50%的幾率.若受到某種因素影響，就會偏離這種幾率，偏離程度越大，表明該因素的影響越大.壓力不對稱指數（PAI）就是基于這種理念進行計算的.文中的計算方法同文獻［8］，均采用John H.McDonald等提出的方法［17-18］.其計算式為

式中：A為非嗜壓蛋白中某位點的氨基酸；B為嗜壓蛋白質對應位點的氨基酸；QAB為非嗜壓蛋白中氨基酸A出現的位點在嗜壓蛋白相應位點被B氨基酸取代的比例；QBA的含義則相反.

需要指出的是，最近，McDonald對算法進行了修訂，將指數值的中點數從1改為0，他認為這能更敏感的反應數據的特性［6］.因此，本文計算的PAI值不能直接和之前結果比數值大小，而主要是考察20種氨基酸PAI值的排序情況.

1.4 氨基酸理化性質及相關性分析

文中使用了70種氨基酸的理化性質，如親疏水性、極性、分子量、等電點、分子表面可及性、分子體積、熱容、吉布斯自由能、形成二級結構的傾向性、電荷分布、側鏈相互作用參數、平均柔性指數、長距離相互作用等.這些數據來源于 AA Index數據庫（http：／／www.genome.jp／aaindex／）［19］.

將計算所得的20種氨基酸的壓力不對稱指數同其70種理化性質分別進行相關性分析，軟件為STATISTICA 9.0（30天完整功能試用版），選取相關系數較大，顯著性較高的理化性質進行分析［8］.

2 結果和分析

2.1 壓力對蛋白質氨基酸使用偏性的影響

比較了473對嗜壓和非嗜壓同源蛋白中20種氨基酸的替換情況，結果如表1所示.該樣本中共統計了185 621個氨基酸，其中有21 662個氨基酸位點發生了替換，樣本量足夠用于統計氨基酸使用上可能存在的某種趨勢.

從表1可看出：在20種氨基酸中，有6種氨基酸沒有出現差異有統計學意義的氨基酸使用偏性，占總數量的30%，它們分別是C（半胱氨酸）、D（天冬氨酸）、H（組氨酸）、M（甲硫氨酸）、W（色氨酸）和Y（酪氨酸）；而出現差異有統計學意義最多的氨基酸是K（賴氨酸），其次I（異亮氨酸）和N（天門冬酰胺）.

經統計，在380個不同氨基酸對中，有12對存在差異有統計學意義的氨基酸使用偏性，結果如表2所示.表2中：Forward表示非嗜壓蛋白突變為嗜壓蛋白；Reverse表示嗜壓蛋白突變為非嗜壓蛋白.從表2可知：差別最大是VI（纈氨酸－異亮氨酸），在嗜壓蛋白中有1 062個位點是Ile，而在非嗜壓蛋白對應的位點卻為Val；同時，嗜壓蛋白中有763個位點是Val，而對應的位點在非嗜壓蛋白卻是Ile，即嗜壓蛋白有1 062個Val突變成Ile，僅有763個從Ile突變成Val，二者之間差異達極有統計學意義的水平.

表1 嗜壓和非嗜壓菌473對同源蛋白中氨基酸替換的矩陣Tab.1 Amino acid substitution matrix in the 473orthologous proteins from piezophiles and non－piezphilies

然而，僅僅從表2中這些差異有統計學意義的氨基酸對仍難以得到一個完整的兩種類型蛋白中氨基酸使用偏性的模式.因此，需要統計其他所有氨基酸向某種氨基酸突變的總趨勢.例如：非嗜壓蛋白中除W（色氨酸）以外的其他19種氨基酸向嗜壓蛋白中W突變的總數量，以及嗜壓蛋白中除W（色氨酸）以外的其他19種氨基酸向非嗜壓蛋白中W突變的總數量.通過這兩組數據的比較，找出其突變總趨勢，并在此基礎上計算W的PAI值.

表2 473對同源蛋白中替換差異有統計學意義的氨基酸對Tab.2 Most statistical bias amino acid pairs in 473homologous proteins

經統計及計算后，20種氨基酸替換總體數據及其PAI值如表3所示.PAI值越大，表明該氨基酸更容易出現在嗜壓蛋白中，其嗜壓性能越強.由表3可知：Trp（色氨酸，W）和Ile（異亮氨酸，I）的嗜壓性能最強，其次分別為Lys（賴氨酸，K）、Cys（半胱氨酸，C），Met（甲硫氨酸，M）和 Leu（亮氨酸，L）；而Pro（脯氨酸，P）、Gly（甘氨酸，G）和Asn（天冬酰胺）則為最不嗜壓氨基酸.這與之前報道差異明顯.

表3 20種氨基酸的PAI值Tab.3 PAI values of the 20amino acids

例如：文中Trp為嗜壓性能最強的氨基酸，而在之前研究中它確是屬于最不嗜壓的氨基酸之一；而文中最不嗜壓的Gly在之前研究中卻是位于第2嗜壓的氨基酸.Trp側鏈具有芳香結構，其分子中的π電子能夠與帶正電的離子如鈉離子和鉀離子相互作用，被稱為“陽離子－p”相互作用，這對維系蛋白分子結構穩定性非常重要［20］.Ile的側鏈為分支的異丙基，能更有效提高蛋白分子表面的柔性，增加其穩定性［21］，故其嗜壓性能也較強.Pro的剛性較強，過多的Pro容易導致蛋白分子剛性太強，不利于其穩定性［22］.Gly雖側鏈很小，易占據蛋白分子內外空間，方便其折疊，但它卻是非極性氨基酸，而極性氨基酸之間及其與水分子間較容易形成極性相互作用，這對維持蛋白質在高壓條件下的穩定性非常重要［5］.Chou等［23］的研究表明，Asn，Gly和Pro很容易出現在轉角和無規則轉曲中，是強烈的轉角和轉曲形成子；過多的轉角或無規則轉曲會導致蛋白質結構不緊湊，從而降低其穩定性［24］.因此，這3種氨基酸的嗜壓性能最低.

2.2 氨基酸壓力不對稱指數與其理化性質相關性分析

將計算所得PAI值與氨基酸的70種理化性質分別進行相關性分析，得到了相關系數較大（｜r｜＞0.49，p＜0.05）的13個理化性質，如表4所示.表4中的13個理化性質，包括氨基酸固有的理化性質參數（分子體積、折射率等）、熱力學參數（熱容、水解自由能）、結構參數（螺旋作用面積、螺旋－無規則卷曲平衡常數、無規則轉曲形成趨勢）、親疏水性參數（疏水性轉移指數、疏水性環繞指數）和可及表面積（accessible surface area，ASA）等.在這13個理化性質中，只有氨基酸的無規則卷曲傾向性（coil tenden－cies，CT）與PAI值呈負相關，其他的均為正相關.其中，氨基酸分子的大小與其PAI值呈正相關（r＝0.531，p＝0.013）.這說明氨基酸分子體積越大，其嗜壓特性越強，這與之前的報道相反［8］.

表4 與PAI相關系數最大的13個理化性質Tab.4 Significant physicochemical properties correlated with PAI

雖然體積小的氨基酸殘基更容易占據蛋白分子內外空間，有助于蛋白質折疊［8］，但分子體積更大的氨基酸更容易讓蛋白分子中的空穴的數量和體積減少，而這對蛋白質的穩定性具有積極作用［25］.氨基酸水合自由能是指其在溶解狀態下與其周圍一層水分子發生相互作用的強弱，它與氨基酸自身的疏水性及與水分子的接觸面積正相關［26］.研究表明：高壓條件下蛋白質結構的變化主要是由于其水合作用的變化所引起的，而可及表面積較大的氨基酸（尤其是位于分子表面）更容易和水分子接觸，增加這種水合作用，從而保證其在高壓條件下的穩定性［27］.這同時也解釋了氨基酸分子可及性與PAI之間這種明顯的正相關性（表4和圖1）.

圖1 PAI與氨基酸可及表面積的相關性Fig.1 Correlation of amino acids accessible surface area with PAI

圖2 PAI與氨基酸無規則卷曲傾向的相關性 Fig.2 Correlation of amino acids coil tendencies with PAI

此外，在高壓條件蛋白變性過程中，當水分子進入到疏水內核區后會加劇蛋白質變性的過程.因此，在其分子中需要增加疏水性氨基酸的數目，以抵制水分子的進入，同時也減少分子中空穴的數量和體積，避免水分子快速進入［28］.這說明了PAI值和氨基酸疏水性及氨基酸體積大小有較強的正相關性.

在其他一些極端蛋白（如嗜熱和嗜鹽）中，二級結構的組成含量及不同二級結構中氨基酸組成存在明顯差異［29］.文獻［9］的研究也表明：嗜壓和非嗜壓蛋白在不同二級結構中氨基酸組成差異明顯，這種現象可通過PAI值與氨基酸不同二級結構傾向因子解釋.經檢查，PAI值和α－螺旋傾向因子的相關系數為0.34，和β－折疊傾向因子的相關系數為0.44，和轉角傾向因子的相關系數為－0.43，而和無規則卷曲傾向因子的相關系數為－0.53，4種相關性均達有統計學意義的水平（p＜0.05）.可見，PAI值與α－螺旋傾向因子相關性最小，與無規則卷曲傾向因子相關性最強（表4和圖2）.PAI值與β－折疊傾向因子呈較明顯的正相關，即表明越容易形成β－折疊的氨基酸其嗜壓性能越強，如Trp和Ile是強烈的β－折疊形成子，其嗜壓性能最強，因此，在嗜壓蛋白的β－折疊出現的頻率也最高［9］.另一方面，PAI值和轉角及無規則卷曲傾向性呈負相關，尤其是和無規則卷曲.眾所周知，Pro和Gly是強烈的轉角及無規則卷曲形成子，其非嗜壓性能最強，因此，在非嗜壓蛋白的轉角或無規則卷曲中含量也最高［9］，而Ile是強烈的轉角及無規則卷曲破壞子，故其嗜壓性能很強，在嗜壓蛋白的轉角或無規則卷曲中含量也最高［9］.

3 結論

由于高壓對生物分子（尤其是蛋白質或酶）的獨特影響使其在不同領域受到了共同的關注［2］.但在真正廣泛應用之前，有一個基本的問題擺在面前，那就是高壓條件下蛋白質結構與其功能有何關系，是否能在認知其構效關系的基礎上設計出耐高壓的酶.由此也可見，了解蛋白質在高壓條件下穩定性的機理在理論和應用上均具有重要價值.

通過嚴格選取目前發現嗜壓菌最多的Shewanella的2對微生物，獲取其全蛋白質組序列，并從中選取473對直系同源序列，盡最大可能地減少了其他因素對最終結果的影響，計算出氨基酸壓力不對稱指數.該結果與之前報道存在較大差異.究其主要原因，可能是由于之前研究選取的是Pyrococcus屬的2個微生物，這兩種微生物屬古菌，同時也是生長在高溫條件下的是嗜熱菌.本實驗選取的是細菌，且生長在低溫條件下，也許是其中的嗜壓蛋白在不同溫度及不同系統發育階段會有不同適應壓力的機制，已有研究者注意到這種現象［30］.但無論如何，研究結果至少可作為對之前所得氨基酸壓力不對稱指數的補充及修正，這對了解占嗜壓菌大多數的低溫菌中嗜壓蛋白穩定性機制應該更具有參考價值，相關研究仍需進一步深入.

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Revision of the Amino Acid Pressure Asymmetry Index of Piezophilic Proteins

ZHANG Guang－ya
（College of Chemical Engineering，Huaqiao University，Xiamen 361021，China）

A comparison was made between 473orthologous proteins fromShewanella.The pattern of asymmetries in the 21 662amino acid mutation sites reveals some common trends.The pressure asymmetry index（PAI）identifies the amino acids tryptophan（Trp）and isoleucine（Ile）as those having the most piezophilic behavior，and proline（Pro），glycine（Gly）and asparagines（Asn）as the least piezophilic，which is totally different from the former result.The PAI makes it possible to visualize the amino acid properties that best explain piezophily.Among the 70properties of amino acids，there are 13significantly correlated with PAI value.Only the coil tendencies are negatively correlated with PAI value，that is to say，on average，higher PAI values are associated with fewer tendencies to form coil.The PAI we established here may be more suitable to the piezophiles living in the cold environment，and a revision of the previous PAI values was made.

piezophilic microbes；pressure asymmetry index；amino acid；coil tendencies；appropriate pressure mechanism

黃曉楠 英文審校：劉源崗）

Q 936

A

1000－5013（2012）01－0044－07

2011－06－11

張光亞（1975－），男，副教授，主要從事酶與生物信息學的研究.E－mail：zhgyghh＠hqu.edu.cn.

福建省自然科學基金資助項目（2007J0360）；華僑大學高層次人才科研啟動項目（10BS220）