雙酶法酶解豬瘦肉蛋白工藝優化研究

鄭培君 蔣愛民 邱 美 沈科能

（華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642）

雙酶法酶解豬瘦肉蛋白工藝優化研究

鄭培君 蔣愛民 邱 美 沈科能

（華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642）

為制備臘味香精提供更豐富的前體物，以豬瘦肉為原料，水解度為指標，選用Alcalase和Flavourzyme為試驗用酶，通正交試驗優化雙酶法水解豬瘦肉蛋白最佳工藝條件。結果表明：Alcalase和Flavourzyme水解瘦肉蛋白其最佳條件為，pH 9時，用1 000U／g Alcalase于60℃下水解6h，再用2 500U／g Flavourzyme于50℃、pH 4.5繼續水解4h。此時，水解度達到34.82%，比Alcalase和Flavourzyme單酶水解度分別提高34.12%和27.48%，且酶解產物還含有豐富的制備臘味香精的前提物。

臘味；肉蛋白；雙酶法；酶解

肉香味是人類飲食中最重要的香味之一，熱反應是肉味香精形成的最主要的途徑之一［1］。豬瘦肉具有全面豐富的營養物質和風味物，特別是含有能顯示出各種肉香味特征的類脂類物質，通過蛋白酶酶解瘦肉肉蛋白可以獲得很多肉味前體物質，如游離氨基酸、胺、多肽等［2］，這些氨基化合物與羰基化合物可進行羰氨反應（Maillard熱反應，后簡稱熱反應），產生醛、酮、酯類等具有特殊風味的物質［3］，故以豬瘦肉酶解蛋白液進行熱反應得到的肉味香精更具逼真和強烈的肉味香氣及優良的產品性能。

蛋白酶水解氮源物質，再經美拉德反應制備肉味香精是肉味香精的主流技術。陳祖杰等［4］等利用蛋白酶解鰱魚肉生產復合調味料。譚斌等［5］以牛肉為底物，通過商品化蛋白酶制備牛肉水解物作為Maillard的反應物，并對酶解產物對美拉德反應風味形成的影響進行了探討。陳能飛等［6］研究了酶法水解豬血紅蛋白制備肉味香精的工藝。徐德峰等［7］選用復合蛋白酶對雞骨架蛋白進行酶解，運用響應曲面法對酶解工藝進行優化，酶解液可作為美拉德反應制備肉味香精的優質底物。傳統的中式臘味肉制品獨特腌臘風味的主要成分多為脂肪的水解氧化產物、蛋白質水解產物以及美拉德反應產物。本試驗采用雙酶法優化蛋白水解工藝，使得蛋白水解液成為適合熱反應制備臘味香精的優質前提物。

但是，酶法水解的動物蛋白有一定的苦味。苦味肽的端基多為疏水性氨基酸，若用外切酶切除此類疏水性氨基酸，游離出的疏水氨基酸與原苦味肽相比苦味要低得多［8］。風味蛋白酶既是內切酶也是外切酶，因此風味蛋白酶在一定程度上能有效脫苦，所以本試驗采用堿性蛋白酶和風味蛋白酶雙酶水解，旨在改善水解效果的基礎上得到更優質的蛋白液。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬瘦肉：冷藏，廣州市好當家連鎖超市；

木瓜蛋白酶（800U／mg）、胰蛋白酶（3 500U／g）、堿性蛋白酶（200U／mg）：廣州市齊云生物技術有限公司；

中性蛋白酶（1.5AU／g）、復合蛋白酶（1.5AU／g）、風味蛋白酶（4×104U／g）：北京諾維信生物技術有限責任公司；

氫氧化鈉、甲醛、鹽酸等：分析純，廣州化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

高速分散均質機：FJ－200，上海標本模型廠；

數顯恒溫水浴鍋：HH－4，常州澳華儀器有限公司；

精密pH計：PHS－3C型，上海虹益儀器儀表有限公司；

離心機：Centrifuge 5804R，上海艾本德生物技術國際貿易有限公司；

全自動凱氏定氮儀：Kjeltec 8200，瑞典Foss公司；

電子分析天平：BSA124S型，德國Sartorius公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

瘦肉→清洗、解凍、絞碎→加水，預煮→調pH→加酶→酶解→滅酶，煮沸15min→4 000r／min離心20min→過濾，冷卻→瘦肉蛋白水解液

1.3.2 總氮量測定 凱氏定氮法，參照 GB／T 5009.5——2010。

1.3.3 游離氨基態氮的測定 甲醛電位滴定法，參照GB／T 5009.39——2003。

1.3.4 水解度的測定 水解度DH表示原料蛋白質中肽鍵被裂解的百分數，即蛋白質被酶催化水解的程度［9］。水解度按式（1）計算：

式中：

DH—— 水解度，%；

N0—— 樣品總氮含量，%；

N1——酶解前游離氨基態氮含量，%；

N2——酶解后游離氨基態氮含量，%。

1.3.5 酶解條件單因素設定 單因素試驗設計采用同種試驗原料，以水解度為評價指標，研究不同蛋白質濃度、pH、溫度、時間和加酶量對蛋白酶水解效果的影響。

1.3.6 兩種酶水解條件的優化 在單因素試驗確定了 Alcalase（堿性蛋白酶）和Flavourzyme（風味蛋白酶）在蛋白質濃度、pH值、溫度、水解時間、加酶量對瘦肉蛋白水解度的影響的基礎上，為得到兩種酶水解瘦肉蛋白的最佳條件，選擇加酶量、pH、溫度、時間4個因素對這兩種酶分別做4因素3水平正交試驗。

2 結果與分析

2.1 水解酶的確定

試驗測得瘦肉蛋白含量為21.81%。以瘦肉為底物，分別用木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、中性蛋白酶，堿性蛋白酶、復合蛋白酶、胰蛋白酶，用去離子水調整蛋白濃度為9%、按表1各酶粗略水解條件進行酶解。

表1 各酶粗略水解條件Table 1 The rough enzyme hydrolysis conditions

由圖1可知，水解效果較好的是風味蛋白酶和堿性蛋白酶，堿性蛋白酶水解后水解液色澤呈透亮的淡黃色，澄清度較好，風味蛋白酶水解后水解液澄清，有很好的肉香味，復合蛋白酶水解液體較渾濁，胰蛋白酶水解液有明顯異味，木瓜蛋白酶及中性蛋白酶水解度相對較低，這與袁永俊等的結果［10］不同，在水解魚肉蛋白酶解工藝采用胰蛋白酶及胃蛋白酶水解效果較好，這可能是由所采用的原料不同所致。綜合考慮上述結果，篩選出堿性蛋白酶和風味蛋白酶為水解酶。

圖1 不同蛋白酶對瘦肉酶解效果的影響Figure 1 Effect of protease on hydrolysis efficiency of Pork protein

2.2 單因素結果分析

2.2.1 蛋白濃度對水解度的影響 由圖2可知，風味蛋白酶在蛋白質濃度為6%時上升速率最高，9%之后趨于平緩。而堿性蛋白酶的趨勢變化不大。隨著豬瘦肉蛋白質濃度增大，酶與底物的接觸機率增大，酶解開始時水解度快速上升；隨著蛋白質濃度的增大，整個反應體系呈膠狀，流動性減弱，導致酶與底物的作用機率減弱，在水解度達到最大之后開始有平緩或降低趨勢［11］。考慮到節約能源，降低成本，所以堿性蛋白酶、風味蛋白酶最佳蛋白質濃度均為9%。

2.2.2 初始pH值的變化對水解度的影響 由圖3、圖4可知，pH對水解效果的影響較顯著。pH值影響酶的穩定性，對水解反應影響很大，故各種酶都有各自的最適pH值范圍。堿性蛋白酶在pH 8.5左右時，水解度最大，為21.76%，風味蛋白酶在pH 5.0左右時，水解度最大，為27.09%，故堿性蛋白酶和風味蛋白酶最適pH值分別取8.5和5.0。

圖2 蛋白質濃度對水解度的影響Figure 2 Effect of protein concentration on hydrolysis degree

圖3 pH值對風味蛋白酶水解效果的影響Figure 3 Effect of pH value on Flavourzyme hydrolysis

圖4 pH值對堿性蛋白酶水解效果的影響Figure 4 Effect of pH value on Alcalase hydrolysis

2.2.3 溫度對水解度的影響 由圖5可知，溫度對水解效果的影響較明顯。在一定溫度范圍內隨著反應溫度升高，水解度不斷增加，但超過一定溫度后，水解度會隨著溫度的升高而降低。這是因為在一定范圍內升高溫度，反應速度加快，酶解效率也相應提高，但溫度過高，酶蛋白變性［12］，酶穩定性下降，酶解效率隨之降低。所以，Alcalase和Flavourzyme的最適溫度均為55℃。

2.2.4 時間對水解度的影響 由圖6可知，隨著時間的增加，水解度不斷增加，當增加到一定程度，增加的速度開始變慢，這是由于隨著水解的進行，蛋白質底物逐漸減少，酶解產物不斷積累對酶本身造成抑制［13］。綜合考慮效率與成本的問題，單因素水解時間Alcalase為5h，Flavourzyme為3h。

圖5 溫度對水解度的影響Figure 5 Effect of temperature on hydrolysis degree

圖6 反應時間對水解度的影響Figure 6 Effect of reaction time on hydrolysis degree

2.2.5 酶添加量對水解度的影響 由圖7可知，隨著加酶量的增大，兩種酶的水解度都在增大，當加酶量達到2 000U／g蛋白時，Flavourzyme的水解度達到28.46%，隨后其水解度變化不大，當加酶量達到1 500U／g蛋白時，Alcalase的水解度達到25.87%，隨后其水解度增加緩慢。

圖7 加酶量對水解度的影響Figure 7 Effect of protease dosage on hydrolysis degree

2.3 兩種酶水解條件的優化

在單因素試驗確定了Alcalase和Flavourzyme在pH、溫度、時間、加酶量對瘦肉蛋白水解度的影響的基礎上，為得到兩種酶水解瘦肉蛋白的最佳條件，選擇pH、溫度、時間、加酶量因素對雙酶分別做4因素3水平正交試驗因素水平見表2、表3，結果表見表4、表5。

表2 L9（34）Alcalase正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experimental design of Alcalase

表3 L9（34）Flavourzyme正交試驗因素水平表Table 3 Factors and levels of orthogonal experimental design of Flavourzyme

表4 Alcalase正交試驗結果表Table 4 The results and analysis of orthogonal experiment

由表4、表5可知，pH對Alcalase水解度的影響最大，其次為溫度、時間和加酶量，最佳方案為A2B2C2D2，即加酶量為1 500U／g，pH為8.5，溫度為55℃，水解時間為5h。該條件下瘦肉蛋白的水解度為22.94%。同樣對Flavourzyme做正交試驗，得出其最佳水解條件為加酶量2 000U／g、pH 5.0、溫度55℃、水解時間4h，該條件下水解度為26.25%。底物濃度均為9%。

表5 L9（34）Flavourzyme正交試驗結果表Table 5 The results and analysis of orthogonal experiment

2.4 雙酶組合對水解度的影響

根據表4、表5得出的最佳水解條件，向同樣底物濃度為9.0%的豬肉懸浮液中加入 Alcalase酶水解6h后高溫滅酶，然后調至Flavourzyme酶的最佳水解條件，加入Flavourzyme酶水解（或改變加入雙酶的水解順序），測定水解度，并與單一酶的水解度比較，結果見圖8。

圖8 水解酶加入方式的比較Figure 8 The Comparison of the hydrolas ezyme addition method

由圖8可知，雙酶法比單獨使用一種酶酶解的水解度明顯提高，比Alcalase和Flavourzyme單酶水解度分別提高34.12%和27.48%，所得產品水解徹底，為 Maillard反應制備臘味香精提供優質的前體物。這與陳晶等的研究結果［14］較為相似。

3 結論

采用Alcalase酶和Flavourzyme酶雙酶分布水解瘦肉蛋白的最佳條件：蛋白濃度9.0%，pH 9.0時，加1 000U／g蛋白質Alcalase酶于60℃水解6h；酶水解后高溫滅酶，再用2 500U／g蛋白Flavourzyme酶于pH為4.5、溫度為50℃下繼續水解4h。在此工藝下，瘦肉蛋白的水解度可達34.82%，比單獨用Alcalase酶和Flavourzyme酶水解水解度分別提高34.12%和27.48%，且此條件下得到的酶解液肉香濃郁，無苦味，多肽及氨基酸種類多，有豐富的制備臘味香精的前體物可以用于臘味香精的研發。

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4 陳祖杰，鄧后勤，夏立新，等.酶解鰱魚肉生產復合調味料［J］食品與機械，2009，25（5）：153～155.

5 譚斌，丁霄霖，劉立國.牛肉蛋白水解舞的特性及其模式體系的Maillard反應［J］.食品科學，2004，25（11）：64～68.

6 陳能飛，丁霄霖.酶法水解豬血紅蛋白制備肉味香精的研究［J］.中國調味品，2006（3）：35～38.

7 徐德峰，張衛明，孫曉明，等.雞骨架蛋白酶制備肉味香精反應底物的研究［J］.中國調味品，2007（6）：36～38.

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10 李清春，張景強.水解蛋白的特性及在食品中的應用［J］.食品工業，2001，4（3）：7～9.

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12 Pinto E Silva M E M，Mazzilli R N，Cusin F.Composition of hydrolysates from meat［J］.Journal of Food Composition and Analysis，1999（12）：219～225.

13 王亞林，陶興無，鐘方旭.堿酶兩步法提取米渣中蛋白質的工藝研究［J］.中國油脂，2002，27（3）：53～54.

14 陳晶，劉友明，熊善柏，等.復合蛋白酶與風味蛋白酶分步水解魚骨蛋白工藝的優化［J］.華中農業大學學報，2007，26（5）：704～708.

Study on the optimization hydrolysis condition of lean pork protein with twice enzymolysis method

ZHENG Pei－jun JIANG Ai－ming QIU Mei SHEN Ke－neng

（College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong510642，China）

For the preparation of meat flavor to provide more abundant precursors，taking lean pork meat as raw material，degree of hydrolysis as an index，Alcalase and Flavourzyme were chosen as the two tool－enzymes.For the sake of getting the optimum conditions of two－enzyme hydrolysis，the orthogonal experiment was conducted.The results showed that the optimum conditions of enzymatic hydrolysis was hydrolyzing protein with 1 000U／g Alcalase at pH 9.0，60℃for 6hours and then with 2 500U／g Flavourzyme at 50℃，pH 4.5for another 4hours，its hydrolysis degree could be reached 34.82%.Compared with those of hydrolyzing with Alcalase and Flavourzyme alone，hydrolysis degree were increased by 34.12%and 27.48%，respectively，and full of precursor of meat flavors for Millard reaction.

Cured and roasted meat；lean protein；twice enzymolysis method；enzymatic hydrolysis

10.3969／j.issn.1003－5788.2012.01.060

廣東省重大專項（編號：2009A020101002）

鄭培君（1988－），女，華南農業大學在讀碩士研究生。E－mail：peijun99＠yahoo.com.cn

蔣愛民

2011－08－01