siRNA干擾Gal-3對Eca-109食管癌細胞株CyclinD1、p21、p27蛋白表達及細胞增殖的影響

鄒國紅 孫軍祥 蘇正 董麗儒 宋旭東

·論著·

siRNA干擾Gal-3對Eca-109食管癌細胞株CyclinD1、p21、p27蛋白表達及細胞增殖的影響

鄒國紅 孫軍祥 蘇正 董麗儒 宋旭東

目的探討siRNA干擾Galectin-3 mRNA后，食管癌Eca-109細胞株增殖活性的影響及Galectin-3、CyclinD1、p21、p27蛋白的表達。方法將Galectin-3-siRNA轉染食管癌Eca-109細胞株后，分別用Real-time PCR、MTT、流式細胞術和免疫細胞化學分別檢測轉染效率、細胞增殖活性、細胞周期分布及Galectin-3、CyclinD1、p21、p27蛋白的表達。結果食管癌Eca-109細胞增殖活性明顯減少，主要分布在G1期，Galectin-3和CyclinD1蛋白表達下降，p21和p27蛋白的表達升高。結論運用siRNA可有效抑制Galectin-3蛋白的表達及細胞增殖活性，Galectin-3參與食管癌Eca-109細胞株的增殖與CyclinD1、p21、p27蛋白關系密切，Galectin-3可成為治療食管癌的靶基因。

Galectin-3;CyclinD1;p21;p27;Real-time PCR、siRNA;食管癌

Galectin-3是Galectin(半乳凝素)家族的重要成員之一，廣泛表達于正常上皮細胞和免疫細胞，參與多種生物學過程，包括細胞增殖、分化、粘附、凋亡及新生血管形成。研究顯示，Galectin-3與腎癌、甲狀腺癌、結腸癌、胃癌、肝癌和乳腺癌等多種腫瘤的生長、浸潤和轉移密切相關［1］。本研究采用RNAi技術，將針對人Galectin-3基因的siRNA轉染入Eca-109食管癌細胞系，觀察Eca-109食管癌細胞系增殖情況及CyclinD1、p21、p27蛋白的表達，探討Galectin-3在食管癌發生、發展中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 Eca-109食管癌細胞株購自中國醫學科學院細胞庫。Lipofectamine2000轉染試劑購自 Invitrogen公司，MTT及RPMI-1640培養基購自Sigma公司，PBS、胰酶及胎牛血清購于中科院血研所，Galectin-3、CyclinD1、p21、p27鼠抗人單克隆抗體及免疫細胞化學相關試劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。RT-PCR Master Mix及PCR引物購自上海生物工程有限公司。Galectin-3引物序列:上游5-CTGGGCCACTGATTGTGCCTTAT-3，下游 5-TCCTGTTGTTCTCATTGAAGCGTG-3;內參GAPDH引物:上游5-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3，下游5-AGGGGCCATCCACAGT CTTC-3。

1.2 siRNA的設計 從GenBank數據庫中獲得Galectin-3基因序列(基因編號NM002306)，利用Ambion公司提供的軟件設計siRNA序列，經Blast進行同源序列比對，在Galectin-3 siRNA序列的不同部位選擇3條與其它基因序列比較同源性小于連續16nt的序列。siRNA sense5’-GUACAAUCAUCGGGUUAAATT-3’，antisense5’-UUUAACCCGAUGAUUGUACTG-3’;陰性對照組sense 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，antisense 5’-ACGUG ACACGUUCGGAGAATT-3’;陽性對照組 GAPDH sense 5’-GUAUGACAACAGCCUCAAGT T-3’，antisense 5’-CUUGAGGCUGUUGUCAUACTT-3’;以上序列均由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。

1.3 細胞轉染 實驗分為4組。空白對照組(不加入siRNA和轉染劑)、轉染組(加入針對Galectin-3的siRNA及轉染劑)、陰性對照組(加入針對陰性對照的siRNA及轉染劑)、陽性對照組(加入針對內參GAPDH的siRNA及轉染劑)。取對數生長期的細胞接種在60 mm培養瓶中，調整細胞為1.0×106/瓶。在37℃、5%CO2濃度、飽和濕度條件下培養，至60 mm培養瓶中細胞匯合率達到70%～80%。0.2%胎牛血清同步化24 h。按照上海吉瑪制藥技術有限公司《RNAi產品使用手冊》每瓶加入siRNA 10 μg和Lipo 2000 10 μl進行轉染。

1.4 Real time-PCR及定量分析 應用實時熒光定量PCR技術檢測RNA干擾對Galectin-3表達的抑制效果。Trizon法提取總RNA，逆轉錄及RT-PCR反應體系參照試劑說明書。逆轉錄Galectin-3 mRNA為cDNA反應條件:(1)37℃15 min;(2)85℃5 s。Galectin-3 cDNA擴增條件:(1)預變性，95℃ 30 s，repeat 1;(2)PCR反應，95℃5 s，58℃30 s，repeat 40。

1.5 Galectin-3、CyclinD1、p21、p27蛋白表達的檢測 37℃ 5% CO2培養箱中培養48 h后采用免疫細胞化學檢測Galectin-3、CyclinD1、p21、p27蛋白的表達情況。染色后的細胞爬片經自動圖像分析系統進行半定量分析，每個爬片隨機取6個視野，每個視野分析細胞數約為30個，取其平均光密度值為量化指標。

1.6 MTT法檢測癌細胞株的增殖情況 細胞轉染48 h后，于倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，繼續培養4 h，終止培養并吸去孔內培養液。每孔加入150 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD 450 nm處測量各孔的吸光值，計算抑制率(抑制率=1－實驗組OD值/空白對照組OD值×100%)。

1.7 流式細胞儀檢測各組細胞周期數的變化 食管癌Eca109細胞轉染48 h后用0.25%胰酶消化并收集細胞，3 000 r/min離心5 min。用8 ml PBS制備單細胞懸液，加2 ml 75%預冷乙醇，吹打均勻，置4℃固定過夜。次日4℃ 3 000 r/min離心5 min，吸棄乙醇，用PBS重懸2次。加入PI染液500 μl，4℃避光孵育20 min，上機檢測，所得結果用細胞周期擬和軟件ModF-it分析。

1.8 統計學分析 應用SPSS 11.0統計軟件，計量資料以ˉx±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR結果 Galectin-3及內參GAPDH引物標準曲線，示M值分別為－2.732和－2.787，二者之差小于0.1，表示擴增效率相同，可用△△Ct值法對二者進行相對定量分析。Ct值和樣本起始拷貝數有對應關系，Ct值越高起始拷貝數越少，對照組與實驗組拷貝數之比為差異倍數即2-△△Ct，2-△△Ct＞1示表達下降，反之增高。實驗組中Galectin-3 mRNA表達量低于兩對照組(P＜0.05)，而對照組差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 不同組別中Eca-109食管癌細胞株△Ct值n=6，±s

表1 不同組別中Eca-109食管癌細胞株△Ct值n=6，±s

組別 △Ct P值轉染組4.39±1.16陰性對照組 1.79±0.62 0.000空白對照組1.89±0.15 0.000 0.843

2.2 Eca109食管癌細胞株的增殖情況 應用Gal-3-siRNA轉染Eca-109食管癌細胞株后，通過倒置相差顯微鏡觀察轉染后培養48 h細胞，轉染組與陰性對照組、空白組比較，細胞生長變得緩慢，細胞體積變小，核質比變小，瘤巨細胞減少，部分細胞脫落。運用MTT法檢測Gal-3-siRNA干擾48 h后，轉染組Eca-109食管癌細胞的抑制率為59.71%，轉染組與空白對照組、陰性對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.01)。見表2。

表2 不同組別中Eca-109食管癌細胞株的OD值和抑制率n=10，±s

表2 不同組別中Eca-109食管癌細胞株的OD值和抑制率n=10，±s

組別 OD(±s) P值 抑制率(%)空白對照組1.43±0.12 -轉染組 0.58±0.19 0.000 59.71陽性對照組 0.77±0.18 0.000 0.350 46.15陰性對照組1.65±0.14 0.144 0.000 0.000 －15.38

2.3 Eca-109食管癌細胞Galectin-3、CyclinD1、p21、p27蛋白的表達 采用免疫細胞化學技術檢測siRNA干擾后Eca-109食管癌細胞Galectin-3蛋白陽性表達主要位于細胞核與細胞漿，CyclinD1、p21、p27蛋白陽性主要位于細胞核，均呈棕黃色或棕褐色。以IOD值作半定量分析，轉染組Galectin-3、CyclinD1、p21、p27蛋白表達均顯著低于空白對照組和陰性對照組(P＜0.01)。轉染組與陽性對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表3。

表3 Galectin-3、CyclinD1、p21和p27蛋白在不同組別中的表達 n=10，±s

表3 Galectin-3、CyclinD1、p21和p27蛋白在不同組別中的表達 n=10，±s

組別IOD Galectin-3 CyclinD1 p21 p27轉染組2.96±0.22 39.5±0.8 29±4 26±5陽性對照組 2.85±0.21 40.4±0.6 28±3 25±4空白對照組 14.06±0.21 61.8±0.5 99±16 84±15陰性對照組13.25±0.10 62.3±0.6 93±14 78±13

2.4 流式細胞儀檢測各組癌細胞周期變化 Galectin-3-siRNA轉染食管癌細胞系Eca-109 48 h后，轉染組、陽性對照組G1期細胞數百分比較空白對照組和陰性對照組明顯升高，S期細胞數百分比較空白對照組和陰性對照組明顯減少(圖1～4)。轉染組、陽性對照組、陰性對照組和空白對照組G1期細胞數百分比分別為66.42±0.17、65.44±0.42、36.76±0.15和35.63± 0.36，轉染組、陽性對照組與空白對照組和陰性對照組比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)。轉染組、陽性對照組、陰性對照組和空白對照組S期細胞數百分比分別為23.2±1.3、24.3 ±1.7、46.8±0.8和45.3±0.7，轉染組、陽性對照組與空白對照組和陰性對照組比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表4。

表4 不同組別中G1期和S期的百分比 n=3，±s

表4 不同組別中G1期和S期的百分比 n=3，±s

組別 G1期(%) S組(%)轉染組66.42±0.17 23.19±1.28陽性對照組 65.44±0.42 24.32±1.73空白對照組 35.63±0.36 45.33±0.72陰性對照組36.76±0.15 46.79±0.76

圖1 空白對照組細胞周期分布圖

圖2 陰性對照組細胞周期分布圖

圖3 轉染組細胞周期分布圖

圖4 陽性對照組細胞周期分布圖

3 討論

人類Galectin-3基因位于染色體14q21-22，相對分子質量約31×103，由6個外顯子和5個內含子組成。Galectin-3通過與其相應配體相互作用參與多種生理和病理過程，包括細胞生長和凋亡、細胞粘附及新生血管形成和腫瘤浸潤與轉移等［2］。李曉明等［3］利用設計的Galectin-3-siRNA能夠使MCF-7乳腺癌細胞中Galectin-3的表達降低90%左右。當用凋亡誘導劑處理時，Galectin-3被抑制的穩定細胞株的凋亡率比野生型細胞株高出近20%。提出在MCF-7乳腺癌細胞中，Calectin-3具有抑制腫瘤細胞凋亡的功能。在人類前列腺癌細胞株LNCaP中，Galectin-3可抵抗由順鉑介導的細胞凋亡［4］。Takenka等［5］將Galectin-3 cDNA轉入到TAD-2甲狀腺濾泡細胞后，細胞出現集落性增殖，提示Galectin-3可能參與了細胞的有絲分裂。同時還發現參與細胞周期G1/S期轉換的RB(retinoblastoma)、PCNA(proliferating cell nucler antigen)、RCF(replication factor C)基因呈高表達。因此，提出Galectin-3在細胞增殖周期中發揮重要作用。雷彩霞等［6］采用siRNA技術抑制Galectin-3 mRNA和蛋白的表達，結果RL-95-2子宮內膜上皮G1期細胞明顯增多，S期細胞明顯下降，說明Galectin-3可以影響子宮內膜上皮細胞的生長周期。以上結果提示Galectin-3主要是通過細胞周期調控和細胞凋亡途徑參與腫瘤細胞的生長過程。本實驗采用Lipo2000脂質載體轉染Eca-109食管癌細胞48 h后，轉染組Galectin-3 RNA及蛋白表達顯著低于空白對照組和陰性對照組，癌細胞生長開始變得緩慢，細胞體積縮小，核質比變小，瘤巨細胞減少。轉染組癌細胞增殖活性顯著降低，細胞主要停留在G1期，與空白對照組和陰性對照組比較差異有統計學意義。該結果與上述文獻報道相一致，提示Galectin-3在Eca-109食管癌細胞增殖過程中發揮重要作用。

Cyclin-D1蛋白是細胞周期素中的重要一員，它可促進細胞快速通過G1期，加速G1/S期的轉化，從而可以促進細胞的增殖，導致細胞周期調控紊亂，使得腫瘤快速生長、發展。有學者研究發現在乳腺浸潤性導管癌中Cyclin-D1蛋白發生了染色體的易位，而導致Cyclin-D1蛋白的表達增加，從而引起細胞周期調控異常，出現細胞增殖紊亂［7］。Yan等［8］利用反義RNA載體轉染2BS細胞系，使得Cyclin D1蛋白的表達下降，促使細胞停留在G1期，同時降低二氧化硅對2BS細胞的致癌能力。最新研究發現Galectin-3是Wnt/β-catenin信號途徑的關鍵調節因子，其與β-catenin、TCF-4組成三元復合物，共同活化CyclinD1的轉錄［9］。p27和p21作為細胞周期負性調控因子，具有廣泛抑制各種細胞周期蛋白和激酶的活性，作為CyclinECDK2、CyclinD-CDK2等G1期激酶復合體的抑制劑，二者以化學計量的方式抑制現已知的大多數Cyclin-CDK的磷酸化激酶活性而阻止細胞通過G1/S期轉化的限制點，從而實現對細胞周期調控。Wang等［10］在敲出人類前列腺PC3細胞株Galectin-3后使細胞停滯于G1期，并上調核P21表達。本實驗結果顯示通過Gal-3-siRNA抑制Galectin-3蛋白表達后，細胞增殖活性受到抑制，同時CyclinD1蛋白表達下降、p27和p21蛋白表達升高，提示Galectin-3參與Eca-109食管癌細胞增殖的作用與CyclinD1、p27和p21蛋白關系密切，Galectin-3有望成為食管癌抑制的靶基因。

1 劉建明，宋旭東，孫軍祥，等.siRNA干擾半乳凝素-3后對食管癌Eca-109細胞株增殖的影響.河北醫藥，2010，32:2796-2798.

2 Leffler H，Carlsson S，Hedlund M，et al.Introduction to galectins.Glycoconj J，2004，19:433-40.

3 李曉明，李平，馬清鈞，等.半乳凝集素-3的表達對乳腺癌細胞MCF-7細胞凋亡的影響.生物技術通訊，2007，18:894-896.

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Effects of Galectin-3 small interfering RNA on the expressions of Cyclin D1，p21，p27 protein and the effect on cell proliferation of Eca109 esophageal carcinoma cell line

ZOU Guohong*，SUN Junxiang，SU Zheng，et al.*Department of Thoracic Surgery，Tangshan People’s Hospital，Hebei，Tangshan06300，China

ObjectiveTo observe the changes of cell proliferation activity and expressions of Galectin-3，CyclinD1，p21 and p27 protein in Eca-109 cell line after transfected by Galectin-3 small interfering RNA (siRNA).MethodsThe Galectin-3 siRNA chain was constructed and transfected into Eca-109 cell line by lipofectamine 2000，then Real-time PCR，MTT，Flow cytometry and immuocytochemistry were respectively used to detect the transfection efficiency of siRNA，the cell proliferation activity，cell cycle distribution and the expression levels of Galectin-3，Cyclin D1，p21 and p27protein in Eca-109 cell line.ResultsThe cell proliferation activity of Eca-109 cell line was significantly decreased，and cell distribution was mainly at G1 stage，and the expression levels of Galectin-3 and Cyclin D1 were decreased，however，the expression levels of p21 and p27 protein were increased.ConclusionThe application of siRNA can effectively inhibit the expression of Galectin-3 and cell proliferation activity of Eca-109 cell line，and Galectin-3 is involved in the proliferation of Eca-109 cell line and is closely correlated with the expressions of Cyclin D1，p21，p27 protein，which may become the target gene for treating esophageal cancer.

galectin-3;cyclinD1;p21;p27;Real-time PCR，siRNA;esophageal cancer

R 735.1

A

1002－7386(2012)17－2565－03

10.3969/j.issn.1002－7386.2012.17.001

063000 河北省唐山市人民醫院胸外科(鄒國紅);河北聯合大學基礎醫學院病理學教研室(孫軍祥、蘇正、董麗儒、宋旭東)

宋旭東，063000 河北聯合大學基礎醫學院病理學教研室; E-mail:songxd2002@sina.com

2011－12－30)