黃連等中藥水煎劑對糞腸球菌的體外抑制作用

于靜 戴東曉 謝景朝 李軍如 陳惠珍

·論著·

黃連等中藥水煎劑對糞腸球菌的體外抑制作用

于靜 戴東曉 謝景朝 李軍如 陳惠珍

目的比較黃連等6種中藥水煎劑對糞腸球菌的體外抑菌效果。方法采用M－H瓊脂稀釋法檢測6種中藥水煎劑對32株糞腸球菌的體外抑菌作用，測定最小抑菌濃度(MIC)、MIC50、MIC90及累積抑菌百分率。結果濃度為1∶320(3.125 mg/ml)時，六種中藥差異有統計學意義(P＜0.05)，黃連抑菌率明顯高于其他組(χ2=56.74P=0.000)。濃度為1∶40(25 mg/ml)時，6種中藥差異有統計學意義(P＜0.05)，五味子、大黃、黃連、連翹抑菌率高于烏梅、黃芩(χ2=8.381，P=0.004)，烏梅、黃芩二者差異無統計學意義(χ2=3.471，P=0.062)。濃度為1∶20(50 mg/ml)時，6種中藥有統計學意義(P＜0.05)，烏梅抑菌率最低(χ2=33.52，P=0.000)。濃度為1∶10(100 mg/ml)時，6種中藥差異無統計學意義(P＞0.05)，抑菌率均為100%。結論6種中藥中黃連抑菌效果最好，烏梅、黃芩作用較弱。

根管消毒;糞腸球菌;中藥;水煎劑;MIC

糞腸球菌(Enterococcus faecalis，E.faecalis)在治療前的根管中并不是優勢菌，但在根管消毒和充填后，其比例卻大大提高，成為最常見的細菌種類。它在根管治療后的根管中為優勢菌，占發現細菌的24%～77%［1］。口腔內科治療中使用的傳統治療方法，難以將定植于根管中的糞腸球菌徹底清除［2］，從而導致根管治療后疾病的發生。近年來，如何抑制或殺滅根管內的糞腸球菌，提高根管治療術的成功率逐漸成為學者們關注的焦點。因此，尋找新型根管消毒藥物是滿足口腔內科牙體治療需要的必然趨勢。本實驗采用瓊脂稀釋法，選用五味子、大黃、黃連、烏梅、連翹、黃芩6種中藥對32株糞腸球菌進行體外抗菌實驗，以期對六種中藥抗糞腸球菌性能作出初步評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑:五味子、大黃、黃連、烏梅、連翹、黃芩，以上品種的中藥飲片，由河北醫科大學第二醫院提供，均購自河北省藥材公司。0.9%氯化鈉溶液(石家莊四藥有限公司，批號:091019107)。Mneller-Hinton瓊脂(簡稱M-H瓊脂，美國BD公司生產)。糞腸球菌32株(石家莊市第二醫院細菌室提供)，所有菌株分離鑒定均參照李仲興編寫的《診斷細菌學》［3］進行，必要時采用微生物鑒定藥敏分析系統鑒定。

1.1.2 設備:Model LS-B75L-Ⅱ全自動立式蒸汽滅菌器(江陰濱江醫療設備有限公司)。多點接種儀(北京醫科大學昆侖藥物發展研究所生產)。電熱恒溫培養箱(山東省濰坊醫療器械廠)。微生物鑒定藥敏分析系統(上海復星佰珞生物技術有限公司)。一次性使用細菌培養皿(直徑為90 mm，江蘇康健醫療用品有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 中藥水煎劑溶液的制備:稱取中藥飲片五味子、大黃、黃連、烏梅、連翹、黃芩各50 g，每味藥分別置砂鍋中，加10倍量水浸泡過夜，后加熱至沸，改用文火煎煮30 min，趁熱濾過，濾渣另加8倍量水，同法煎煮30 min，濾過，合并兩次濾液于燒杯中，水浴濃縮后放涼至室溫，50 ml容量瓶定容，倒入廣口瓶中，高壓滅菌(0.1～0.11 MPa，121℃，15 min)，取出放涼備用，得每毫升相當于原藥材1 g(1∶1)的中藥水煎劑溶液。

1.2.2 藥液稀釋及含藥血平板制備:取無菌試管11只，除第1、10號管外，于其余管中各加0.9%氯化鈉溶液10 ml，于1號管、2號管分別加人1 g/ml中藥水煎劑10 ml，2號管混勻后取出10 ml加入3號管，3號管混勻后取出10 ml放入4號管，如此連續稀釋至9號管，從9號管取出的10 ml放入10號管，第10號管作無菌陰性對照管，第11號管只有0.9%氯化鈉溶液，作無藥陽性對照管。這樣1～9號管均含有10 ml倍比稀釋的藥液，濃度分別為1 000，500，250，125，62.5，31.25，15.63，7.82，3.91 mg/ml(即1∶1，1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256)。

將已配好的無菌M-H瓊脂(pH值為7.4)熔化，在無菌操作下吸取M-H瓊脂16 ml置于三角瓶中，再從1號管中取出4 ml藥液置于同一瓶中，搖勻，倒入平板，凝固后備用，得1號含藥平板，含藥量為200 mg/ml(1∶5)。2～11號平板的制備同1號，這樣1～10號含藥血平板的藥物含量分別為200，100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.563，0.782，0.782 mg/ml(即1∶5，1∶10，1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶140，1∶1280，1∶1280)，第10號含藥平板作無菌陰性對照，第11號平板作無藥陽性對照。

1.2.3 菌液制備及接種:將糞腸球菌新鮮培養物(菌落)用0.9%氯化鈉溶液稀釋制成菌懸液，濃度相當于0.5麥氏比濁管，經稀釋后的受試菌在15 min內以多點接種儀接種，最終接種量為每點104 cfu，菌液接種于含藥平板上，于37℃培養箱中培養24 h，觀察并記錄結果。每種藥物的第10號平板不接種細菌，作無菌陰性對照;第11號平板不含藥物接種細菌，作無藥陽性對照。

1.2.4 最小抑菌濃度測定:觀察含藥平板的菌落生長情況，如果對照菌全部生長，則觀察最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)，以無細菌生長平板內藥物的最小濃度為此藥對該菌株的最小抑菌濃度即MIC。根據含藥平板的菌落生長數及未生長數，統計藥物抑制50%，90%細菌時的最小濃度，即MIC50，MIC90和累積抑菌百分率。

1.3 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 六種中藥水煎劑對32株糞腸球菌的MIC、MIC50、MIC90及累積抑菌百分率結果見表1、2。第10號平板(無菌陰性對照)無糞腸球菌生長。第11號平板(無藥陽性對照)糞腸球菌正常生長。

表1 6種藥水煎劑對32株糞腸球菌的MIC、MIC50、MZC90

表2 6種藥水煎劑對32株糞腸球菌的累積抑菌百分率%

表3 6種中藥水煎劑對32株糞腸球菌的不同抑制作用(1∶320)

表4 6種中藥水煎劑對32株糞腸球菌的不同抑制作用(1∶20)

表5 6種中藥水煎劑對32株糞腸球菌的不同抑制作用(1∶40)

表6 6種中藥水煎劑對32株糞腸球菌的不同抑制作用(1∶10)

2.2 6種中藥水煎劑對糞腸球菌有不同程度抑制作用，同一種中藥對糞腸球菌的不同菌株表現出相近的抑菌活性。黃連抑菌效果最好，其MIC90為1∶320(3.125 mg/ml)。濃度為1∶320 (3.125 mg/ml)時，6種中藥差異有統計學意義(P＜0.05)。再經兩兩比較后得出黃連抑菌率明顯高于其他組(χ2=56.74，P=0.000)。效果較好的有五味子、大黃、連翹，MIC90分別為1∶40(25 mg/ml)、1∶20(50 mg/ml)、1∶40(25 mg/ml);濃度為1∶40(25 mg/ml)時，6種中藥差異有統計學意義(P＜0.05)。再經兩兩比較后得出五味子、大黃、黃連、連翹抑菌率高于烏梅、黃芩(χ2=8.381，P=0.004)。烏梅、黃芩作用較弱，二者差異無統計學意義(χ2=3.471，P=0.062)。且濃度為1∶20 (50 mg/ml)時，6種中藥差異有統計學意義(P＜0.05)。烏梅抑菌率最低(χ2=33.52，P=0.000)。在固體培養基中，中草藥水煎劑抑制糞腸球菌的效果隨藥液濃度的增加而增加。當濃度達到1∶10(100 mg/ml)時，各藥物平板中均無菌落生長(P＞0.05)。6種中藥抑菌率相同，均為100%。見表3～6。

3 討論

多數中藥及其復方制劑具有廣譜抗菌、調節免疫、恢復人體微生態平衡、增強抗感染免疫、干預抗藥性形成和轉導、逆轉抗藥性的特點，這些優勢讓中藥在臨床應用中極具潛力。且中藥水煎劑制備相對簡便，不良反應小，不易產生耐藥性，因此進一步將其用于臨床是十分經濟和安全有效的。有學者通過對腸球菌的體外抗菌活性檢測發現五味子、黃連、烏梅和黃芩對腸球菌有較好的抑菌效果［4，5］;連翹為廣譜抗菌藥;大黃對腸球菌也有一定的抑菌效果［6］。與其他中藥相比，黃連有其獨特之處。因糞腸球菌屬腸球菌屬，以上研究為本實驗選用此六種中藥作為抑制糞腸球菌的實驗藥物提供了參考依據。也有學者將其中的一些藥物應用于口腔及根管消毒，取得了較好的效果。但針對于抑制糞腸球菌的中藥研究卻很少見。本實驗通過選取已被臨床證實對多種病原菌有較好抑菌效果且具有代表性的6種中藥(五味子、大黃、黃連、烏梅、連翹、黃芩)進行體外抗菌效果觀察，發現其對糞腸球菌有體外抑制作用，其試驗結果經檢驗具有統計學意義。這為臨床根管消毒藥物的選擇提供了實驗室依據，并且為口腔醫學中藥物的篩選提供了一種新的具有可行性和實用意義的研究方法。實驗結果顯示黃連水煎劑對糞腸球菌的抗菌作用優于其他參試中藥，考慮與黃連的主要抑菌成分黃連素(小檗堿)有關。黃連素具有廣譜抗菌作用，低濃度抑菌，高濃度殺菌。其作用機制可能是:(1)破壞細菌結構。(2)抑制細菌糖代謝，黃連能抑制酵母菌及細菌糖代謝的中間環節丙酮酸的氧化脫羧過程。(3)抑制核酸、蛋白質合成。

本實驗參考王育紅等［7］24種中藥水煎劑對臨床菌株的體外抑菌作用的藥劑配制及實驗方法。采用常規抑菌實驗方法——瓊脂稀釋法，培養基選用M-H瓊脂對六種中藥進行定量抗菌實驗研究。避免了普通的營養瓊脂中所含某些成分會與中藥的抗菌物質結合而抑制藥物本身的抗菌作用，可大大提高抑菌實驗的靈敏度，也更能精確地反映出6種中藥對糞腸球菌的抑菌效果。并能夠精確測出各種中草藥的MIC值，達到精確篩選抗菌中草藥的目的。

實驗選用32株不同源臨床分離糞腸球菌菌株。實驗菌株是反映抗菌效果的重要指標。不同源菌株對抗菌藥物耐藥程度各不相同，與以往實驗使用同源菌株不同，本實驗具有多源性、多樣性的特點，更接近臨床情況，也更具有代表性和可重復性，使實驗數據更加貼近臨床，更能客觀地反映出每種中藥對臨床糞腸球菌的抑菌效果。

通過本研究我們發現中藥的不同提取方法對其抗菌效果有較大影響。這可能與中藥的有效成分是水溶性還是脂溶性有關。同時各批次間藥物本身質量的不穩定性也在很大程度上影響了藥物濃度的精確獲得，限制了其在臨床上的應用。牙體牙髓疾病是混合細菌感染的過程，僅對其中某一種細菌有較強抗菌效果的藥物在臨床治療中未必能達到理想的療效，這也是我們將進一步研究的方向。

1 Stuart CH，Schwartz SA，Beeson TJ，et al.Enterococcus faecalis:its role in root canal treatment failure and current concepts in retreatment.J Endod，2006，32:93-98.

2 Reynaud Af，Geijersstam AH，Ellington MJ，et al.Antimicrobial susceptibility and molecular analysis of Enterococcus faecalis originating from endodontic infections in Finland and Lithuania.Oral Microbiol Immunol，2006，21:164-168.

3 李仲興主編.診斷細菌學.第1版.香港:黃河文化出版社，1992.200.

4 苗明三，方曉艷.五味子多糖對正常小鼠免疫功能的影響.中國中醫藥科技，2003，10:100.

5 李仲興，王秀華.應用M-H瓊脂進行五倍子等5種中藥對28株腸球菌的體外抗菌活性觀察.中國中醫藥信息雜志，2004，11:1064-1066.

6 岳云升，李仲興，王秀華，等.用新方法進行大黃對308株臨床菌株抗菌活性研究.航空航天醫藥，2004，15:16-18.

7 王育紅，李風學，張志清，等.24種中藥水煎劑與免煎顆粒劑對臨床菌株的體外抑菌作用.江蘇中醫藥，2006，27:52-54.

R 187.1

A

1002－7386(2012)17－2580－03

10.3969/j.issn.1002－7386.2012.17.007

項目來源:河北省醫學科學研究重點課題(編號:20110184)

050051 河北省石家莊市第二醫院口腔科(于靜、戴東曉、謝景朝、李軍如);河北醫科大學第二醫院口腔科(陳惠珍)

陳惠珍，050000 河北醫科大學第二醫院口腔科; E-mail:yhzy359@126.com

2012－02－29)