褐色高溫單孢菌PE—211纖維素酶的純化及固定化研究

　　摘 要： 本研究望能為其在工業、農業、輕工業等方面的應用提供一定的理論依據。研究方法如下：利用搖瓶培養基進行培養，經硫酸銨鹽析、2次SephadexG-100柱純化，用殼聚糖進行固定化。結果是粗酶液被純化，以戊二醛為交聯劑制備固定化酶，得出結論：褐色高溫單孢菌PE-211纖維素酶經硫酸銨鹽析、2次SephadexG-100柱純化，粗酶液被純化47.5倍，比活力為54.15 IU/mg，以戊二醛為交聯劑制備固定化酶。酶動力學研究表明，固定化酶的最適pH為8.5，最適溫度為70℃，且固定化酶在60℃～80℃活力較高；該酶的耐熱性很強，而固定化酶的熱穩定性比原酶強；以羧甲基纖維素鈉為底物，固定化酶的Km為7.19mg/ml，Vmax為0.132mg/ml·min。
　　關鍵詞： 褐色高溫單孢菌 纖維素酶 固定化
　　一、前言
　　在化工資源貯藏量不斷減少的今天，通過可再生纖維素資源的生物轉化生產葡萄糖和乙醇已成為當前研究的熱點[1]-[2]。纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，其最大的潛在用途是把纖維素類物質酶法水解成葡萄糖。迄今為止，已有很多關于纖維素酶生產菌株的研究報道[3]-[4]，但其中多數以真菌如黑曲霉（Aspergillusniger）和木霉（Trichodermareesei）等為研究對象。由細菌、放線菌所產生的中性纖維素酶和堿性纖維素酶，在洗滌劑工業中的應用已引起人們的高度重視[5]-[6]。有關褐色高溫單孢菌PE-211（Thermomonospora fusca PE-211）產纖維素酶的性質，黎海彬等[7]-[8]已做了研究，但對該酶的固定化未見有報道。本研究對發酵的粗酶液進行了純化，再制備成固定化酶，然后對其最適反應溫度、pH值、耐熱性及米氏常數等進行了研究，望能為其在工業、農業、輕工業等方面的應用提供一定的理論依據。
　　二、材料和方法
　　1.實驗材料
　　（1）菌種
　　褐色高溫單孢菌PE-211（Thermomonospora fusca PE-211）[7]。
　　（2）試劑
　　分離介質SephadexG-100（德國Phamacia）；羧甲基纖維素鈉（美國Sigma）；牛血清白蛋白為進口分裝；其余均為國產分析純或化學純。
　　（3）儀器
　　高速冷凍離心機（美國貝克曼公司）；紫外可見分光光度計（上海第三分析儀器廠）；核酸蛋白檢測儀、梯度儀、恒流泵、自動部分收集儀（上海滬西分析儀器廠）等。
　　（4）搖瓶產酶培養基
　　在Hagerdal Medium[3]中加入質量分數為1.0%的微晶纖維素作為碳源。
　　2.實驗方法
　　（1）蛋白質含量測定
　　采用Folin-酚法測定蛋白質含量[9]，以牛血清白蛋白（BSA）做標準曲線。
　　（2）SDS-PAGE[10]
　　采用垂直板式不連續系統電泳，分離膠濃度10%，濃縮膠濃度4%，用0.25%（W/V）考馬斯亮藍G-250染色。
　　（3）殼聚糖的制備[11]-[12]
　　將蝦皮洗凈，然后去掉殘余的蝦肉，用3～4倍量體積的4%的稀鹽酸和10%的NaOH反復處理4～5次，每次8～10h，用水洗至中性。所得的白色幾丁質加入50%的NaOH，于80℃～100℃下保溫處理6～7h后，再水洗至中性，曬干粉碎，過40目篩即得。
　　（4）粗酶的制備[8]
　　在裝有100ml產酶培養基的500mL三角瓶中接入10ml種子液，于55℃、200r/min下培養24～48h，取培養液以4000r/min的速度離心20min，所得上清液即為粗酶液。
　　（5）粗酶液的純化
　　①硫酸銨沉淀和透析。取粗酶液，加入硫酸銨至30%飽和度，在4℃，10000r/min下離心10min，收集沉淀物，再溶于少量磷酸緩沖液中，透析除鹽，制得經硫酸銨沉淀的純化酶液。
　　②葡聚糖凝膠層析。葡聚糖凝膠SephadexG-100經充分溶脹后上柱，柱子經0.10mol/L的pH6.0的磷酸緩沖液充分平衡后上樣，每6min收集一管，分別測定各管的纖維素酶活。
　　（6）纖維素酶的固定化[13]-[14]
　　取一定量的殼聚糖于6%的戊二醛中攪拌2.5h，4℃過夜，然后洗去殘余的戊二醛，在交聯后的殼聚糖中加入纖維素酶液，室溫下攪拌2.0h，于4℃靜置過夜，再洗去游離酶，即得固定化酶。
　　（7）纖維素酶（CMCase）活力的測定及定義[15]
　　酶活力的測定以羧甲基纖維素鈉鹽（CMC-Na）作底物，經纖維素酶水解后生成還原糖，然后用DNS（二硝基水楊酸）法測定還原糖的含量，由還原糖的量來求得酶活力的大小。
　　取0.5ml適當稀釋的酶液，與1.5ml質量分數為0.7%的CMC-Na溶液混合，在65℃下反應30min，取出加入3mlDNS顯色液，然后煮沸5min，停止反應，冷卻，于分光光度計上530nm處比色（空白試驗中除酶液事先滅活外，其余條件不變）。
　　一個酶活單位被定義為在1min內轉化底物產生1μmol還原糖（按葡萄糖計）所需的酶量。
　　（8）固定化酶的動力學
　　分別在不同的pH及溫度下，測定其對酶反應速度的影響，并在不同的底物濃度下測定固定化酶的米氏常數K和V。
　　三、結果
　　1.硫酸銨沉淀
　　發酵粗酶液經離心去除菌體和殘渣后，在其上清液中緩慢加入硫酸銨至30%的飽和度，4℃過夜，離心、去除雜蛋白。于上清液中緩慢補加入硫酸銨至80%飽和度，4℃過夜，離心收集沉淀，沉淀物溶于檸檬酸緩沖液中。透析檢查無銨離子后，計算其收率為65.73%。
　　2.第一次SephadexG-100柱層析
　　經硫酸銨鹽析后的透析液加到平衡好的SephadexG-100柱上，再用同樣的緩沖液洗脫，洗脫曲線為三個峰（峰Ⅰ、峰Ⅱ、峰Ⅲ），經檢測主要的纖維素酶活力包括在峰Ⅲ中，但SDS-PAGE結果表明還有雜蛋白存在，其純化倍數為30.87，結果見表1。
　　3.第二次SephadexG-100柱層析
　　將第一次洗脫峰Ⅲ合并，進行第二輪SephadexG-100柱層析，纖維素酶活都包括在峰Ⅲ中，SDS-PAGE結果表明酶的純度很高。將具有纖維素酶活的峰Ⅲ合并，測定每一步純化操作中的蛋白濃度和酶活力，計算比活力，結果見表1。結果表明，經過SephadexG-100柱純化后，酶的比活力為54.15IU/mg，提純倍數為47.50。
　　4.不同酶量對固定化酶活力的影響
　　取7份1.5g殼聚糖與戊二醛的交聯物，分別加入2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml的酶液，固定化后測定其酶活力，結果見圖1。
　　5.固定化纖維素酶的最適pH
　　取一定量的固定化酶，分別在pH為5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0下測定其酶活力，結果發現固定化酶在pH為8.5時，酶的活力最高，如圖2所示。
　　6.固定化纖維素酶的最適溫度
　　取一定量的固定化酶，分別在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃下測定其酶活，結果發現固定化酶在溫度為70℃時，酶的活力最高。
　　7.固定化纖維素酶的耐熱性實驗
　　取10份固定化酶和原酶，分別置于70℃的水浴中，每間隔10min取出一管，按上述方法測定其酶活力，連續進行100min，結果如圖4所示。
　　8.固定化酶的米氏常數
　　用等量的固定化酶與不同的底物濃度于65℃下反應15min，測定其吸收值，用雙倒數作圖法作圖，測定酶的米氏常數和最大反應速度，結果見表2。由雙倒數作圖可知，以CMC-Na為底物，固定化纖維素酶的Km為7.19mg/ml，Vmax為0.132mg/ml·min，而原酶液的Km為7.27mg/ml。
　　四、討論
　　圖1結果表明，隨著加入酶量的增加，其酶活力隨著增大，但當加入的酶量增加到一定程度時，酶活力增加變得緩慢，這可能是由于在酶的固定化過程中，一定量交聯后的載體，其活性基團是一定的，結合位點未被飽和之前，固定化酶的活力會隨加入酶量的增加而增大，一旦結合位點被飽和后，再增加加入的酶量卻不能增加酶活力。
　　如圖2所示，原酶的最適pH值為9.0，可能由于殼聚糖是陽離子型載體，因而固定化酶的最適pH值比原酶要低。
　　如圖3所示，而且固定化酶的熱穩定性較原酶高，在60℃～80℃時酶活力都較高。這表明纖維素酶經固定化后，對熱的穩定性明顯提高。
　　圖4的結果表明，褐色高溫單孢菌纖維素酶的耐熱性很強，保溫100min后，固定化酶的酶活基本保持不變，而且固定化酶比原酶具有較高的熱穩定性，由此可以看出，固定化酶的適應性更強，可廣泛應用于工業、農業、輕工業等各個方面。
　　表2結果表明該纖維素酶在固定化后，其米氏常數略有減小，說明纖維素酶經固定化后，與底物的親和力有所增加。
　　五、結語
　　褐色高溫單孢菌PE-211纖維素酶經硫酸銨鹽析和SephadexG-100柱純化后，粗酶液被純化47.5倍，比活力為54.15IU/mg。酶動力學研究表明，固定化酶的最適pH為8.5，最適溫度為70℃，且固定化酶在60℃～80℃活力較高；該酶的耐熱性強，而固定化酶的熱穩定性比原酶強；以羧甲基纖維素鈉為底物，固定化酶的K為7.19mg/ml，V為0.132mg/ml·min。
　　有關褐色高溫單孢菌PE-211固定化纖維素酶在解決能源危機及可再生資源利用等方面有待進一步研究。
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