發(fā)酵液中分離提純透明質(zhì)酸

　　摘 要：透明質(zhì)酸微生物發(fā)酵液中往往都含有蛋白質(zhì)、核酸等雜質(zhì)，因此需要分離純化。只有高純度的透明質(zhì)酸才能更好的發(fā)揮其工業(yè)效用，但是分離純化的方法卻多種多樣。目前主要方法有過濾法、凝膠層析法、離子交換層析法等，而不同的方法又將導(dǎo)致操作、成本、和純度的不同。因此本文將從多方面多角度綜合分析各種透明質(zhì)酸分離純化方法。
　　關(guān)鍵詞：透明質(zhì)酸多糖發(fā)酵分離提純過濾凝膠層析離子交換
　　中圖分類號：Q53文獻標(biāo)識碼：A文章編號：1672-3791（2012）03（a）-0000-00
　　透明質(zhì)酸( Hyaluronic acid，簡稱HA)又名玻璃酸，是一種由D-N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸為結(jié)構(gòu)單元的酸性高分子粘多糖。HA具有許多天然多糖共有的性質(zhì)：呈白色，為無定形固體，無臭無味，有強吸濕性，溶于水，不溶于有機溶劑。它是一種國際上公認的生物大分子保濕劑，用于眼科顯微手術(shù)、關(guān)節(jié)炎治療、高檔化妝品、食品添加劑等領(lǐng)域[1]。
　　1分離提純透明質(zhì)酸
　　發(fā)酵法生產(chǎn)的HA 具有分離精制容易，保濕性強，品質(zhì)穩(wěn)定，產(chǎn)量大等優(yōu)點，目前已得到廣泛使用，并已成為研究 HA生產(chǎn)的主要方向。由于微生物發(fā)酵液中提取的透明質(zhì)酸粗品都含有菌體，雜蛋白、核酸等雜質(zhì)，需要進一步分離純化。以下簡單介紹幾種工業(yè)上常用的發(fā)酵液中透明質(zhì)酸的分離提純的方法：
　　1.1過濾法
　　過濾法分離純化發(fā)酵液中的HA是一種簡單有效并可以規(guī)模化生產(chǎn)HA的分離純化方法，可以有效地除去菌體和雜蛋白，對分子量的影響相對較小。鄧禹等[2]采用25g/L三氯乙酸滅活菌體并使蛋白質(zhì)變性沉淀，以發(fā)酵液質(zhì)量1.2% 的混合硅藻土為過濾助劑，過濾溫度為 60℃，pH 為7.0的透明質(zhì)酸發(fā)酵液預(yù)處理工藝，完全去除了透明質(zhì)酸發(fā)酵液中的菌體和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。采用這一工藝得到的成品透明質(zhì)酸中葡萄糖醛酸含量達46.39%，蛋白質(zhì)含量僅為 0.047%，分子量為190萬，提取收率為 91.3%。這種方法利用三氯乙酸滅活菌體并使蛋白質(zhì)變性沉淀，然后以硅藻土作為過濾助劑吸附、截留蛋白質(zhì)和菌體的透明質(zhì)酸發(fā)酵液預(yù)處理方法。
　　1.2凝膠層析法
　　凝膠層析法是生物化學(xué)中一種常用的分離手段，凝膠層析是依據(jù)不同分離純化目的和 HA 分子量大小選擇合適的分子篩進行分離純化的，透明質(zhì)酸分子量達幾十萬到幾百萬，而蛋白質(zhì)的分子量僅為幾萬，所以選擇合適的凝膠可以起到分離純化的效果。吳華昌等[3]采用葡聚糖凝膠G-100，以0.1mol/L氯化鈉溶液為洗脫劑，以H A提取率與純度為指標(biāo)，對HA發(fā)酵液進行分離純化，再用醇沉法提取HA，擬達到提高HA提取率和純度的目的。在優(yōu)化的凝膠層析條件下，HA提取率達到79.85%，蛋白質(zhì)去除率為84.93%。
　　1.3離子交換層析法
　　如果采用化學(xué)方法從發(fā)酵液中分離純化透明質(zhì)酸，純化過程中的p H值、光、熱和還原劑等因素易導(dǎo)致其黏度發(fā)生不可逆的下降。而在進入HA純化階段后，由于離子交換層析等具有選擇性吸附特點的層析技術(shù)已經(jīng)成為分離提取生物大分子的有效方法。倪杭生等[4]采用強酸型陽離子樹脂為交換劑的離子交換柱，和經(jīng)組氨酸基團修飾的強堿型陰離子樹脂為交換劑的離子交換層析柱串聯(lián)。選擇以氯化鈉溶液為洗脫劑，在優(yōu)化的洗脫條件下，對HA 粗品進行分離純化，純化重量收率為 58%～61%，分子量近100萬。HA粗品溶液先通過交換柱，其中主要雜質(zhì)蛋白質(zhì)是兩性物質(zhì)，在偏酸性溶液中帶正電荷，能與強酸型陽離子發(fā)生交換吸附而被純化。
　　2透明質(zhì)酸分離提純方法的分析總結(jié)
　　從發(fā)酵液中分離提純透明質(zhì)酸是發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的關(guān)鍵步驟之一，而目前報道的去除HA發(fā)酵液中菌體和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的方法有過濾法、凝膠層析法、離子交換層析法等。雖然過濾法具有設(shè)備簡單、操作方便、試驗重復(fù)性好、成本低廉，且能有效去除蛋白質(zhì)類雜質(zhì)，但提純效率相對還是比較低的，這種方法通常只用于透明質(zhì)酸的初期分離純化。凝膠層析是基于被分離組分之間的分子量大小不同而起到分離的效果，這樣就避免了化學(xué)方法純化HA過程中的pH、酶、光、熱和還原劑等因素導(dǎo)致糖苷鍵的水解或分子間解聚，避免了黏度發(fā)生不可逆的下降。但凝膠層析法成本較高，且分離提純HA的提取率也比較低。離子交換法基于被分離組分與交換劑之間存在的靜電作用，離子交換層析分離條件溫和，不引起分子結(jié)構(gòu)的變化，這具有很強的優(yōu)越性。與化學(xué)提取法相比，離子交換法的提取率還較低，離子交換樹脂的化學(xué)修飾比較困難，因此在離子交換劑的選擇以及離子交換樹脂的基團修飾方面還需要進一步的研究。面對這諸多問題每種分離純化方法也都存在一定的局限性，單一的分離純化方法并不能達到很高的純化程度，只有根據(jù)制備HA的不同要求在不同階段選擇適當(dāng)?shù)姆蛛x純化的方法，并對工藝過程和方法進行系統(tǒng)優(yōu)化，才能獲得高純度、高分子量的HA。因此從發(fā)酵液中分離純化HA 往往是由多種分離純化方法聯(lián)合完成。所以，對于發(fā)酵液中透明質(zhì)酸的提取方法還有待于進一步的研究探索。
　　3透明質(zhì)酸展望
　　2004年全球的H A在化妝品和醫(yī)療用途上，銷售總值高達3 0～4 0億美元，還以每年20％的遞增率增長。在HA的研發(fā)上，國內(nèi)外學(xué)者開始著重于對 HA 進行修飾及對其衍生物的應(yīng)用進行研究，以解決純H A易溶于水、 吸收迅速和在組織中停留時間短等特性。在HA 分離提純工藝研究的重點將是對分離純化方法優(yōu)化組合，精細化操作，降低生產(chǎn)成本的同時提高分離純化工藝的安全性，操作上的簡捷性，探索適合于工業(yè)化生產(chǎn)的工藝路線，在提高 HA 純度的同時盡量保持高的分子量。因此，H A的研發(fā)以及純化工藝的改進將成為當(dāng)前的發(fā)展趨勢。
　　參考文獻
　　[1]