污水處理廠耐β—內酰胺類乳糖發酵型腸桿菌Ⅰ類整合子及基因盒研究

徐佳麗+王小嬌+張明+任雪麗+江濤

摘 要：該文首先用 PCR等方法，對閔行污水處理廠分離的β-內酰胺類抗性菌株中Ⅰ類整合子和基因盒的存在情況進行測定；其次，對含有Ⅰ類整合子-基因盒的抗性菌株抽提質粒，分析Ⅰ類整合子-基因盒所在位置；最后，探討了含有整合子-基因盒菌株對多種抗生素的反應。

關鍵詞：β-內酰胺類抗性菌株；Ⅰ類整合子；基因盒

中圖分類號 X703 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）07-15-03

Abstract：In this paper，PCR techniques were used to detect the presence of classⅠintegron and gene β-lactam antibiotics which selected from sewage water samples. Second，the plasmid DNA were extracted from β-lactam resistant strains with classⅠintegron and gene cassette，which detected the position of classⅠintegron and gene cassette. Finally，the response of a strain containing classⅠintegron and gene cassette to antibiotics were investigated.

Key words：β-lactam antibiotics；ClassⅠintegron；Gene cassettes.

1 前言

隨著抗生素使用越來越頻繁，細菌具有了更強的抗藥性，從而使耐藥性廣泛傳播。耐藥基因的水平傳播主要由質粒、轉座子、噬菌體介導，而整合子起著至關作用[1]。Stokes[2]在1989年首次提出了整合子的概念，Hall[3]在1991年正式提出了基因盒-整合子系統的概念。整合子是細菌DNA片段，與細菌耐藥性密切相關[4]，是一種存在于細菌質粒或染色體上的遺傳元件系統，通過自身編碼的整合酶來獲取外源基因并使之表達。

整合子由5′-保守末端（CS）、3′-保守末端及位于2段保守序列之間的可變區組成，它能夠捕獲、整合及表達耐藥基因。5′-CS是整合子的基本結構，包括一個編碼整合酶的IntⅠ基因、一個整合子重組位點attI和啟動子（Pant）[5]。中間可變區域有不同種類和數量的耐藥基因盒，表現出多耐藥特征。而基因盒是一種結構比較小的、自己無法轉錄翻譯，需要借助外界力量來幫助自己表達，而整合子經常是它的首選目標。基因盒通過整合子上整合酶被整合到整合子中或從整合子里被剪切下來，使耐藥基因得以傳播與擴散[6]。3'-CS的結構因整合子種類而不同。

到目前為止，Ⅰ類整合子是研究最多也是被檢測到最多的。Ⅰ類整合子的5′-CS部分一般相似，而3′-CS存在差異。多數3′-保守端有3個開放的基因讀碼框：磺胺耐藥基因（SulⅠ），季銨鹽化合物及溴乙錠的耐受基因（qacE△1），以及功能尚不清楚的ORF5[5]。本實驗主要通過PCR等方法檢測污水廠分離的39株抗性菌株的Ⅰ類整合子以及基因盒的存在情況。通過對含有Ⅰ類整合子-基因盒系統的抗性菌株提取質粒，分析Ⅰ類整合子-基因盒所在的位置。最后，探討了整合子在介導LFE對抗生素產生多重抗性的作用。

2 實驗方法

2.1 樣本采集及DNA的提取 實驗菌株來自閔行污水廠中分離的39株耐β-內酰胺類乳糖發酵型腸桿菌。用水煮法（99.5℃，10min）裂解提取菌落DNA。同時做好標記保存使用。

2.2 抗性菌株Ⅰ類整合子基因檢測 將水煮提取的39個菌落DNA在Ⅰ類整合子基因擴增引物下進行PCR檢測，反應總體系為30μL：3μL 10×PCR Buffer，1.8μL MgCl2，3μL dNTPs，正、反向引物各0.6μL，2μL DNA模板，0.2μL的Taq聚合酶，18.8μL超純水。PCR擴增條件為：94℃預變性5min，94℃變型30s，59℃退火30s，72℃延伸60s，30個循環，最后72℃延伸10min。最后在1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

2.3 抗性菌株Ⅰ類整合子基因盒檢測 用上述使用過的39個菌落DNA在Ⅰ類整合子基因盒擴增引物下進行PCR檢測，反應總體系為30μL：3μL 10×PCR Buffer，1.8μL MgCl2，6μL dNTPs，正、反向引物各1.2μL，4μL DNA模板，0.4μL的Taq聚合酶，12.4μL超純水。PCR擴增條件為：94℃預變性7min，94℃變型40s，59℃退火40s，72℃延伸80s，30個循環，72℃延伸10min，最后在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

2.4 帶Ⅰ類整合子抗性菌株整合子位置確定 用質粒抽提試劑盒（桑尼生物科技有限公司）對閔行污水廠中分離的39株耐β-內酰胺類乳糖發酵型腸桿菌抽提質粒。用PCR方法對抽提的質粒做整合子及基因盒檢測，步驟同上面2個實驗相同。

2.5 β-內酰胺類抗性菌株對多重抗生素的耐藥性研究 將分離出的含有39株β-內酰胺抗性菌株分別轉接于含有濃度為50μg/mL的氨芐西林鈉、16μg/mL的頭孢呋辛鈉、20μg/mL的四環素的麥康凱瓊脂平板中，37℃培養24h。

3 結果與分析

3.1 抗性菌株Ⅰ類整合子-基因盒檢測結果 取9、10、11月從閔行污水處理廠分離出的39株具有2種以上抗性基因的Ⅰ類整合子-基因盒檢測結果，見表1。從表1可以得出：在分離的39株具有多個抗性基因的菌株中，其中約15.38%含有Ⅰ類整合子但不含有基因盒；15.38%含有基因盒但是在intⅠ上沒有檢測到；同時15.38%的菌株檢測出Ⅰ類整合子及基因盒，另外約有30.77%未含有Ⅰ類整合子和基因盒。其中對于都含有Ⅰ類整合子及基因盒的月份上分析：11月份<9月份<10月份，這在一定程度上反應出耐藥性的傳播和抗藥性的爆發期可能與時間有關。由此可知，環境中含有較多的Ⅰ類整合子-基因盒這個系統結構的菌株與環境中細菌抗性藥提高有著密切聯系。

3.2 Ⅰ類整合子-基因盒位置的分析 對含有Ⅰ類整合子-基因盒的6株菌進行了對該系統位置的研究，結果表明，這6株菌的質粒DNA也都能檢測到該系統，說明這6株的Ⅰ類整合子-基因盒系統均位于質粒上。

3.3 β-內酰胺類抗性菌株多重耐藥性的研究 攜帶Ⅰ類整合子-基因盒系統的抗性菌株在不同抗生素中生長情況，結果見表3。從表3可以看出：SA15、OC4、OD6這3株菌能在氨芐西林鈉、頭孢呋辛鈉、四環素這3種抗生素中生長，說明這3株菌對這3種抗生素都具有抗性，即為多重抗性菌。另外，這也從側面反映出含有Ⅰ類整合子-基因盒的細菌對抗生素極易表現出多重抗性。

4 結論

在閔行污水處理廠分離出的39株帶有多重抗性的菌株中，Ⅰ類整合子的檢出率為30.77%，基因盒的檢出率為30.77%，同時帶有整合子-基因盒系統的檢出率為15.38%[7]。對6株含有Ⅰ類整合子-基因盒的β-內酰胺類抗性菌株對其質粒檢測，結果發現在這6株菌的質粒上都檢測到了Ⅰ類整合子-基因盒的存在。β-內酰胺類抗性菌株中的Ⅰ類整合子-基因盒可能位于質粒上。整合子在介導β-內酰胺類抗性菌株對抗生素產生多重抗藥性的過程中起到了重要作用。

參考文獻

[1]馮銀，陳體，伍勇.整合子介導細菌耐藥調控機制的研究進展[J].國際檢驗醫學雜志，2013，34（10）：1260-1262.

[2]Stokes HW，Hall RM.A novel family of potentially mobile DNA elements encoding site-specific gene-integration functions： integrons [J]. Mol Microbiol，1989，3（12）：669-1683.

[3]Hall R M，Collis C M. Mobile gene cassettes and integrons：capture and spread of genes by site-specific recombination [J]. Mol Microbiol，1995，15（4）：593-600.

[4] Seputienv，Povilonisj，Ruzaukasm，et al.Prevalence of trimethoprim resistance genes in Escherichia coli isolates of human and animal origin in Lithuania[J].J Med Microbiol，2010，59 （Pt3）：315-322.

[5]李曉娜，張金寶，王桂琴.整合子-基因盒介導細菌耐藥基因水平傳播的研究進展[J].黑龍江畜牧獸醫科技版，2015（01）：47-49.

[6] Partridgesr，Tsafnatg，Colerae，et al. Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons[J].FEMS Microbiol Rev，2009，33（4）：757-784.

[7]王小嬌.污水廠耐耐β-內酰胺類抗生素乳糖發酵型腸桿菌耐藥基因的研究[D].上海：華東師范大學，2010.

（責編：張宏民）