透明質酸的功能、制備及其在醫學中的應用

摘 要 透明質酸是一種天然的線性黏多糖，具有特殊生理功能。本文簡介透明質酸的功能、各種制備方法以及在醫學方面的進展。

關鍵詞 透明質酸 功能 制備 治療

中圖分類號：R91; R96; TQ464.1 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533(2012)15-0046-06

The function， preparation and medical application of hyaluronan

DU Ping- zhong

(Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry， Shanghai 200040， China)

ABSTRACT Hyaluronan is a natural linear mucopolysaccharide which possesses the special physiological functions. This review briefly introduces the functions， preparations of hyaluronan and its progress applied in medicine.

KEY WORDS hyaluronan; function; preparation; therapy

透明質酸又名玻璃酸（hyaluronan或hyaluronic acid，HA），是Meyer等[1]于1934年從牛玻璃體分離獲得并命名。由于HA是人體皮膚、關節軟骨等組織的天然組分，又在人體的生理代謝中具有特殊功能，近年來受到人們愈來愈多的關注，在醫學、藥學和化妝保健品方面得到廣泛的開發和應用。據估計HA銷售在國際上超過10億美元，在大大地促進HA的研發和生產。本文對HA功能、生產和醫療保健方面的應用進展作一概述。

1 透明質酸的性質與功能

1.1 HA的分布

HA是由β-3-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和β-1，4-葡萄糖醛酸（GlcA）雙糖重復單位構成的線性黏多糖。HA在自然界中分布廣泛，是細胞外基質組份，哺乳動物的結締組織，關節滑液、皮膚、眼玻璃體、臍帶以及雞冠、鯨魚軟骨、鯊魚皮、海藻、軟體動物都含有HA，在原核細胞中它以黏性莢膜存在。在人體中，皮膚含7～8 g HA，占總量的50%以上，臍帶和關節滑液HA含量也很豐富[2，3]（表1）。

1.2 HA的性質

HA為白色無定形或纖維狀物資，無臭，有強吸濕性，易溶于水，不溶于醇、酮、乙醚等有機溶劑，水溶液呈酸性，帶負電。

HA經酸堿或加熱處理，易引起分解，在還原劑，氧自由基，紫外線，X射線或超聲波等的作用下，可使其低分子化。HA還易被透明質酸酶和硫酸軟骨素酶等分解[5]。

1.3 HA的保水性

HA含有多個羥基和羧基，能與水分子形成氫鍵，有強大的保水作用，理論保水值達500 ml/g。它的保水性與甘油等一般保濕劑不同，不易受外界環境影響，不論在低濕度還是高濕度條件下，吸濕性大致相同，因此，HA是一種理想的保濕劑，保濕效果與分子量大小有關，分子量越大保濕效果越好。皮膚保健就是利用這一特性[6]。

1.4 HA的黏彈性

HA在低濃度時，以線狀形式存在，在高濃度時（1%），分子以網狀結構存在，有很高的黏彈性。分子量約200萬0.2%水溶液黏度為1 000 CPS，當濃度增至1%時，其黏度增加1 000倍。黏度大小還受分子量、pH和離子強度等因素影響[5]。

1.5 HA的流變性

在溶液中，HA線性分子骨架內部氫原子形成非極性疏水面，外部側鏈形成親水面，出現一種扭曲的盤旋帶狀結構，具有很獨特的流變性質，超常的潤滑性和很強的親水性。在低濃度時，有異常的流變性，在較高濃度時，有極高但依存剪切的黏度。1% HA溶液象凍膠，但在壓力下，它很容易通過小針孔，被稱為“假塑性材料”。HA溶液獨特的流變性質使它成為理想的潤滑劑，已成功地用于防止手術后黏連[7]。

1.6 HA的生理功能

HA是細胞外基質的必需組份，參與和中介細胞信號傳遞，傷口修復，形態發生和基質組織等生理活動，它能調節與巨噬細胞、粒細胞和淋巴細胞相互作用。在高濃度下，HA抑制巨噬細胞的增殖、移行和吞噬能力，在低濃度下，它反而增強巨噬細胞的吞噬和胞飲能力。對淋巴細胞，它抑制宿主對移植物反應，阻止其增殖[7]。它參與細胞的分化調控，與腫瘤的轉移有密切關系[3]。

HA是帶酸性基團的生物大分子，對細胞外的Ca2+、Mg2+、Na+、K+等陽離子有較大親和力，能調節這些陽離子在細胞表面及其周圍的變化。HA分子可任意卷曲形成三維空間網絡，具有分子篩功能，小分子易通過，大分子則受阻，起著調節蛋白質轉運的功能[2]。

1.7 HA的安全性

HA是人體結締組織的主要成分，與蛋白質結合存在于機體各組織內，本身有極高安全性，大鼠急性毒性LD50：口服500 mg/kg，皮下和腹腔注射2 000 mg/kg。它無抗原性，無過敏反應，無致畸、致突變和致癌作用[6，7]。這表明HA安全可靠，不僅可作為醫藥用品，而且還可作為保健化妝品基質，得到廣泛的應用。

2 透明質酸的制備

由于HA的優良性能以及它在醫療和保健化妝品上的廣闊應用前景，人們一直在研究和開發HA的各種制備方法，從傳統的提取法發展到微生物發酵法，直至用基因重組技術，改造原有菌種或構建新的微生物產生菌，都取得顯著的進展。

2.1 動物組織提取法

在機體組織中，HA幾乎都與蛋白質以共價鍵結合成蛋白聚糖，通常雞冠、人臍帶、牛或豬眼玻璃體和皮膚等含量較高，作為起始原料，經機械切塊破碎后，用堿或蛋白酶降價，使HA與蛋白質分離，用氯仿等有機溶劑去除蛋白質雜質，其溶液經乙醇多次沉淀，再經氯化十六烷基吡啶和無菌處理等精制過程，得到無菌無熱源高純度HA制品[2]。提取時，要防止透明質酸酶和加溫使HA降解低分子化。雞冠等提取工藝耗時費力，勞動強度大，生產成本高，易受HA降解酶影響，制造高純度高分子量產品很困難，而且動物來源大分子有跨種間風險和病毒污染可能，面臨著日益增長的反對，從20世紀80年代起，微生物發酵法逐漸興起，大有替代提取法之勢。

1980年瑞典Pharmacia公司首先從雞冠制備出醫用級HA，占領市場，之后日本、中國等國相繼開發出同類產品，參與競爭。

2.2 微生物發酵法

能合成HA的微生物主要有溶血性鏈球菌，1937年報道鏈球菌A群產生HA，之后發現鏈球菌C群也產生HA，HA存在于鏈球菌的莢膜上，為細菌提供一種隱蔽功能，使機體免疫系統不能識別，免受白細胞的攻擊。A群和C群鏈球菌分別為人和動物的致病菌，前者對人危害大，不適合生產，后者雖對動物致病，但經誘變選育出低毒菌株，可在嚴格控制下生產，常用的生產菌株(表2)是馬鏈球菌、獸疫鏈球菌和類馬鏈球菌的突變株[5，8]。

與提取法相比，發酵法工藝比較簡單，HA以游離態分泌到發酵液中，不含難以分離的蛋白質和其他黏多糖，容易得到高純度高分子量的HA，適合于工業規模生產。常用的生產菌株為獸疫鏈球菌和馬鏈球菌的突變株。1982年日本資生堂開始研究發酵法，1985年開發成功，突變株的HA產量大于5 mg/ml，達到工業化生產要求[5]。典型的HA發酵過程是以葡萄糖為主要碳源，在含蛋白胨、酵母膏、磷酸鹽和硫酸鹽等成分的培養基中，在34～37 ℃，pH 7及通氣攪拌條件下，經過30～48 h發酵，HA產量可達5～7 mg/ml.。發酵液離心去菌體，加沉淀劑去蛋白質，溶液加乙醇沉淀HA，再經氯化十六烷基吡啶、超濾、透析和離子交換等技術處理，去除微量雜質熱源，制得高純度醫用級HA[2]。

HA的發酵受到菌種、基因、培養基和發酵過程各種參數的影響。首先，現在HA生產菌種多為動物致病菌，菌種本身可能分泌透明質酸酶使HA水解，并產生β-溶血素，菌種經NTG等誘變劑處理和一系列選育，以獲得無HA水解酶和溶血素的HA高產菌株。其次，培養基的組成也十分重要，鏈球菌對營養有特殊要求，尤其是營養缺陷型菌株，氮源（酵母膏，蛋白水解液），碳源（葡萄糖，蔗糖）以及二價金屬離子(Mg2+、Mn2+)等適當配合，以求獲得最佳組合。第三，發酵參數的調控，pH，溶解氧，攪拌轉速和型式，菌濃度和糖氮消耗等進行優化組合，由于HA發酵液的高黏性，影響氧和營養物質的傳遞，這樣，HA的產量達5～7 g/L已接近極限[2，8]。

目前，發酵法生產HA占主導地位，日本，歐美和中國都已規模化生產，產品的競爭也日趨劇烈。

2.3 基因重組菌種發酵法

最近十幾年，有關鏈球菌基因測序和代謝工程研究取得很大進展，為構建基因重組菌種打下基礎。HA生產來自動物組織或致病菌發酵，給安全生產帶來一定風險，美國FDA和歐洲EMEA對其生產工藝有嚴格限制。20世紀90年代起，美歐日等國投入巨資，探索用基因工程技術構建非致病菌，開辟了一條轉基因HA生產新途徑，近年來取得突破性的進展，有的已經產業化。枯草桿菌等轉基因HA產生菌屬于一般認為安全認證（GRAS）的菌種，特點是安全性高，無病毒污染或傳播動物病原菌的風險，宿主不產生任何內外毒素，且培養條件要求低，發酵產生的HA直接分泌到培養基中。表3列出HA基因重組菌種等。

枯草桿菌是具有生物合成HA能力的革蘭陽性菌，除沒有透明質酸合成酶外，含有所有必需的酶系。鏈球菌生物合成HA的關鍵酶，在枯草桿菌中都有類似的酶。例如，HA產生菌類馬鏈球菌有透明質酸合成酶基因（hasA），合成HA前體所需的關鍵酶基因，UDP-葡萄糖脫氫酶基因（hasB），UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因（hasC），UDP-N-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶基因（hasD），與天然枯草桿菌相應前體基因分別為tuaD (hasB類似物)，gtaB（hasC），gcaD (hasD) （圖1）。將鏈球菌的hasA與枯草桿菌一個或多個tuaD，gtaB，gcaD作為基因盒整合到枯草桿菌A164D5的amyE所在的染色體上，可獲得高基因穩定性。HA合成過程如圖2[15]，與尿苷二磷酸（UDP）結合的GlcNAc和GlcA單糖進入細胞膜上透明質酸酶內交替轉位連接到線性HA上，之后分泌到細胞外。該菌株在以蔗糖為基礎的培養基中發酵，產生HA分子量約100萬，且低分散度，質量好，工藝簡單且環保[8，10]。這表明基因工程法雖然產量不及發酵法，但鑒于基因技術和代謝工程的優勢，生產工藝安全，產品有保證，前景看好。

3 透明質酸在醫學中的應用

HA具有獨特的高吸濕性和黏彈性，良好的生物相容性，無免疫原性以及降解產物安全等性質，并有多種生理調節功能，因此，它的應用領域在不斷擴大。僅在醫學范圍里，其在眼科，耳鼻喉科，骨科，外科，皮膚科，整形科，組織工程等方面的應用均有報道。在藥學中，除了用作藥物治療外，還可用作藥物載體，調節和控制藥物的吸收與釋放。在美容保健化妝品行業，更成為一種常用不可缺失的基質。由于HA在機體里易被透明質酸酶或自由基降解，半衰期幾小時到幾天，不能滿足外科，皮膚科和組織工程等的臨床需求，一些HA的衍生物和交聯物已開發成功，并開始用于臨床。

3.1 眼科

20世紀80年代，瑞典Pharmacia公司首先將HA產品作為眼外科手術填充劑應用于臨床，目前，HA在白內障摘除、人工晶體植入、角膜移植、視網膜脫離等稱為眼科黏性外科手術中得到普遍應用[16]，到2009年至少2 500萬患者從中得益。HA在手術中滯留于前房，保持手術視野清晰，保護角膜內皮和虹膜組織，減少術間出血和損傷，降低術后炎癥，提高手術成功率。HA對角膜有保護作用，與纖連蛋白結合，促進角膜上皮細胞連接和延伸，加快角膜創傷愈合。近來報道，HA與羥丙甲基纖維素二元組合制劑更適合眼科手術[17]。

以HA為主要成分的滴眼藥液，具有強親水能力和潤滑作用，可穩定淚膜，延長淚液破裂時間，防止角膜和結膜干燥，減輕眼組織摩擦，緩解干眼癥的不適癥狀，用于治療干燥綜合癥，眼干燥癥，以及手術、外傷和配戴隱形眼鏡所致的角膜結膜上皮損傷，也用于改善隱形眼鏡配戴舒適度[17]。

3.2 耳鼻喉科

鼓膜穿孔是由中耳感染、外傷等引起的，尤其對兒童學習語言有很大影響。HA制劑以及衍生物直接滴入鼓膜穿孔患者中耳內，可加快穿孔鼓膜的閉合，改善疤痕質量，縮短愈合時間，產生新鼓膜，改進聽力，且對耳蝸無毒性[18]。這是一種技術簡單，經濟省時的方法，適合于干性鼓膜穿孔患者的鼓膜成形術。目前，還需進行大規模隨機對照臨床試驗后，才能確保HA常規使用[19]。

在聲帶襞瘢痕治療上，HA交聯后有希望用于聲帶開始損傷時防止瘢痕生成，而對已形成的瘢痕可使固有膜復原，但其療效仍需進一步確認[20]。

3.3 骨科

HA注入關節腔內，增強關節液的潤滑功能，促進軟骨的愈合與再生，抑制疼痛，減少炎癥，用于治療各種骨關節炎取得較好療效[21，22]。另外，在退行性關節炎和整形科領域，如對椎間盤退化的修復與再生，HA能促進軟骨細胞分化，維持椎間盤和骨髓基底細胞活性，也顯示出治療潛力[23]。

3.4 外科

在腹部手術后，腹腔黏連并發癥的風險約為29.7%，最常見的并發癥是小腸梗阻，病人需重新入院治療。HA作為基質的抗黏連劑，可使手術時暴露在空氣中器官組織保持水分，減少或防止相互黏連。機理是在受損的腹腔表面HA進行機械隔離，也有調節細胞增殖的作用。HA-CMC(羧甲基纖維素)制成的無菌可生物再吸收的抗黏連膜，1996年美國FDA批準用于腹腔手術防黏連，如經腹腔鏡治療潰瘍性腸炎，家族性結腸息肉，子宮肌瘤切除和疝修復等都很有前途[24]。

3.5 皮膚科

HA用于燒傷、創傷或皮膚潰瘍治療時，涂敷在傷面上，形成一層薄膜，既可免受細菌感染，又可透氣保持創面干燥；低分子HA還能滲透到真皮層，促進上皮再生，促進愈合。HA局部用于治療急性放射上皮炎，腿靜脈潰瘍和糖尿病腳等[25]。

3.6 組織工程

HA是細胞外基質的必需成分，由于它無毒、極好的生物相容性和降解性[26]。在組織工程和再生醫學中，以HA為基礎的生物材料，構建成合成的細胞外基質，作為支架和載體，參與干細胞傳遞，生長分化，組織修復，形態生成等生理活動，成為制造新型機體組織最重要的建筑塊[27]。如從皮膚、肝臟、心肌、軟骨和神經等組織獲得的先祖細胞和成熟細胞，可按規格定制培育出所需的組織與器官[28，29]。

3.7 藥物傳輸系統

HA是多種生理功能的天然線性多糖，不僅用于組織工程前景廣闊，而且作為藥物載體也進展迅速。HA及其各種衍生物、交聯物制成液體、凝膠、微粒和膜等劑型，可將生物活性小分子或蛋白多肽大分子，通過局部給藥，注射，植入等方式將藥物送至疾病部位，達到藥物緩釋或控釋的目的[30，31]。HA與腫瘤細胞上過表達的CD44受體親和力較強，有望成為癌癥靶向治療的手段[31]。美歐國家批準HA作為雙氯芬酸鈉的藥物載體，明顯延長藥物半衰期，局部治療光化角化病、骨關節炎、基底細胞癌等[32]。

3.8 保健化妝品

HA優良的吸濕性，對皮膚又無毒無刺激，能清除自由基，幾乎所有各種化妝品如乳劑、霜劑、唇膏、香波和浴劑等都含有HA。它有助于皮膚水化，吸收水分，形成薄膜，滲透到上皮中去，還可防止皮膚免受紫外輻射[33]。皺紋是由于皮膚老化和HA丟失引起的，2003年美國FDA批準HA注射液用于去除臉部的皺紋，填充軟組織缺損，增加皮下空間，減少皺紋深度，使臉部平滑[34]。

4 結語

HA是一種黏性高分子的多糖，在現有的生物提取法，發酵法和基因工程法中，后二者在工藝路線，產品安全和生產成本上具有更大的優勢。HA優良的生物理化特性和多種多樣的生理功能，使其在醫藥保健領域里得到廣泛的應用，它的各種衍生物將成為組織工程和藥物傳輸系統中所需的新型生物材料和載體。

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（收稿日期2012-06-30）