女性生殖道感染致精子DNA損傷與胚胎停育關(guān)系的研究

摘要 目的：研究女性生殖道感染致精子DNA損傷與胚胎停育的關(guān)系。方法：分別用彗星電泳方法擇定胚胎停育女性（研究組）和正常胚胎發(fā)育女性（對(duì)照組）生殖道分泌物孵育后精子。結(jié)果：研究組彗星細(xì)胞平均尾長和1，2，3，4級(jí)彗星細(xì)胞的百分率均較對(duì)照組相對(duì)應(yīng)的值顯著性增高。結(jié)論：早期胚胎停育與女性生殖道感染引起的精子DNA損傷相關(guān)。

關(guān)鍵詞 胚胎停育 生殖道感染 DNA損傷

各種原因?qū)е碌娜祟惾焉镔|(zhì)量的下降以及人們對(duì)高質(zhì)量妊娠的期盼已經(jīng)成為熱點(diǎn)問題。已有大量的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)精子在男性生殖器發(fā)育成熟過程中如遭受射線、化學(xué)毒性物質(zhì)、病原微生物等攻擊后可致不育或受精后早期胚胎停育［1～5］。在近年來的臨床工作中，我們發(fā)現(xiàn)部分胚胎停育女性伴隨較嚴(yán)重的生殖道感染。為了研究這些感染造成的不良陰道和宮頸管環(huán)境是否會(huì)造成精子DNA損傷而致早期胚胎停育，并評(píng)價(jià)女性生殖道分泌物對(duì)精子DNA損傷的檢測(cè)在預(yù)測(cè)不良妊娠中的價(jià)值，選擇合并中、重度生殖道感染（依據(jù)于癥狀、婦科檢查及實(shí)驗(yàn)室檢查）的孕早期胚胎停育女性31例與早期正常胚胎發(fā)育女性30例作為對(duì)照，采集陰道穹窿和頸管分泌物孵育質(zhì)量指標(biāo)正常的精進(jìn)行孵育后精子彗星電泳分析。現(xiàn)將方法和結(jié)果報(bào)告如下，并進(jìn)行相應(yīng)分析討論。

資料與方法

一般資料：研究組31例為婦科檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查合并有陰道和宮頸感染，配偶精液常規(guī)分析各質(zhì)量指標(biāo)正常，圍孕期月經(jīng)周期25～35天，估計(jì)受孕時(shí)間為50～90天，年齡24～32歲，臨床及實(shí)驗(yàn)室、B超檢查證實(shí)胚胎停止發(fā)育。對(duì)照組30例選擇圍孕期月經(jīng)周期25～35天，估計(jì)受孕時(shí)間50～70天，B超檢查早期胚胎發(fā)育正常，因計(jì)劃外受孕要求終止妊娠的女性，年齡21～33歲。正常精液由接受圍孕期生殖健康檢查、精液分析質(zhì)量指標(biāo)正常，年齡25～30歲的健康男性提供。31例組研究組女性均未做過孕前生殖健康方面的檢查。孕早期婦查合并中、重度陰道炎和或?qū)m頸炎體征。實(shí)驗(yàn)室陰道后穹窿和宮頸管分泌物病原體檢查16例復(fù)雜假絲酵母菌感染，4例陰道毛滴蟲感染，8例細(xì)菌性陰道病，2衣原體感染，1例淋球菌感染。對(duì)照組30例女性陰道和宮頸婦檢及分泌物實(shí)驗(yàn)室檢查無感染的癥像。

試劑與儀器：低熔點(diǎn)與正常熔點(diǎn)凝膠，生命技術(shù)公司產(chǎn)品。其他試劑均為Sigma公司產(chǎn)品。Nikon AFX-A Ⅱ型熒光顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品。

陰道分泌物和宮頸黏液的采集與精子的孵育：用無菌吸管采集陰道和宮頸黏液約2ml置無菌試管于37℃水浴箱中。精液樣本3～5天禁欲后用自慰的方法收集于無菌容器中，37℃水浴箱中溫育20分鐘使其液化，根據(jù)文獻(xiàn)［4］做精液常規(guī)質(zhì)量分析，取2ml質(zhì)量指標(biāo)正常的精液，各分1ml放置于研究組和對(duì)照組陰道穹窿和宮頸分泌物中，37℃水浴箱溫育30分鐘后進(jìn)行彗星電泳分析［6］。

精子洗滌和凝膠設(shè)置：首先，待檢測(cè)精子用Phosphate-buffered saline（PBS）洗滌（1500r/分，10分鐘）3次，然后以2×106 cells/ml的濃度懸浮在PBS中。在冰凍玻片上鋪上100μl 075%的正常熔點(diǎn)凝膠，在室溫下靜置5分鐘使得凝膠凝固。8μl精子細(xì)胞懸液與72μl 075%低熔點(diǎn)凝膠充分混合后鋪在第一層凝膠上，4℃靜置8分鐘使其凝固，100 μl 075%低熔點(diǎn)凝膠鋪在第二層凝膠上，4℃再靜置8分鐘。細(xì)胞裂解與DNA解旋玻片在含有25mM NaCl，100mM Na2-EDTA，10mM Tris，1% sodium lauryl sarcosine，1% Triton X-100（pH10）的裂解液中4℃條件下作用1小時(shí)以裂解精子細(xì)胞。然后，玻片浸泡在包含25mM NaCl，5mM Tris，005% sodium lauryl sarcosine，10μg/ml RNase（pH74）的溶液中37℃條件下作用4小時(shí)。最后，玻片在含有25mM NaCl，5 mM Tris，005% sodium lauryl sarcosine，200μg/ml proteinase K（pH74）的溶液中，37℃條件下作用15小時(shí)。電泳、中和、染色玻片在含有300mM sodium acetate and 100mM Tris （pH10）電解液中4℃條件下平衡20分鐘。然后，在12V（046V/cm）、100mA、4℃條件下電泳60分鐘。最后，再在含有04M Tris-HCl的緩沖液（pH74）中4℃中和5分鐘，用45μl of ethidium bromide （15μg/ml）染色、封片。

鏡檢和圖象分析：使用目鏡測(cè)微尺測(cè)量每個(gè)精子細(xì)胞核的彗星尾長，并根據(jù)彗星尾部DNA的含量將精子細(xì)胞核損傷程度分為5級(jí)：①0級(jí)：彗星尾部熒光強(qiáng)度小于總強(qiáng)度的5%，無損傷（核基本完整）；②1級(jí)：5%～20%，輕度損傷；③2級(jí)：20%～40%，中度損傷；④3級(jí)：40%～95%，重度損傷；⑤4級(jí)：＞95%，完全損傷（核基本消失）每個(gè)樣本做3張片，每張片記數(shù)100個(gè)精子。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)均用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理，研究組與對(duì)照組之間的差異用Student t-test進(jìn)行。

結(jié) 果

陰道穹窿和宮頸分泌物孵育后彗星電泳分析胚胎停育組精子平均慧尾長度較正常對(duì)照組差異有顯著性。見表1。

討 論

理論上，在精子生長和運(yùn)行的過程中，如果表達(dá)微管的基因受到損傷，其和卵子受精產(chǎn)生的胚胎將有可能因停止發(fā)育而流產(chǎn)。人精子在女性生殖道停留最長的部位是陰道穹窿部宮頸管。生殖道感染病局部炎性反應(yīng)可以造成生殖道微環(huán)境細(xì)胞毒性因子的異常增多和pH值的變化。本研究證實(shí)合并生殖道感染的胚胎停育女性其陰道穹窿和宮頸管分泌物孵育后的精子其DNA損傷較正常對(duì)照組差異有顯著性，提示早期胚胎停育與生殖道不良環(huán)境導(dǎo)致的精子DNA損傷相關(guān)。彗星電泳分析女性生殖道分泌物對(duì)精子DNA損傷和預(yù)測(cè)早期妊娠結(jié)局。建

議在圍孕期保健的臨床路徑中，應(yīng)重視女性生殖道感染的檢查和治療，并以生殖道分泌物孵育后精子彗星電泳DAN損傷分析作為圍孕期生殖健康評(píng)估的重要手段。

參考文獻(xiàn)

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