結核分枝桿菌熒光定量聚合酶鏈反應與噬菌體生物擴增法早期診斷結核性滲出性胸膜炎的應用價值

摘 要 目的：探討熒光定量聚合酶鏈反應檢測技術與噬菌體生物擴增法在早期診斷結核性滲出性胸膜炎的臨床應用價值。方法：對145例結核性滲出性胸膜炎患者行胸腔穿刺抽液術，標本送檢結核分枝桿菌的熒光定量聚合酶鏈反應、噬菌體生物擴增法檢測，并對兩種方法進行比較。結果：熒光定量聚合酶鏈反應檢測陽性率531%，高于噬菌體生物擴增法324%，P＜001有極顯著差異，聚合酶鏈反應檢測明顯優于噬菌體生物擴增法。結論：結核分枝桿菌的熒光定量聚合酶鏈反應對早期診斷結核性滲出性胸膜炎有重要的診斷價值；噬菌體生物擴增法有一定參考價值。

關鍵詞 聚合酶鏈反應 噬菌體生物擴增法 結核性滲出性胸膜炎

doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.14.253

Abstract Objective:The objective of this paper is to discuss the clinical application value of fluorescence quantitative PCR and phage amplified biologically assay in the early diagnosis of tuberculous exudative pleurisy.Methods:145 tuberculous exudative pleurisy patients were operated paracentesis.The samples were detected by mycobacterium tuberculosis fluorescence quantitative PCR and phage amplified biologically assay.Then the two methods were compared.Results:The positive rate in fluorescence quantitative PCR was 53.1%，higher than 324% in phage amplified biologically assay，P＜001，with a significant difference，which shows fluorescence quantitative PCR is apparently better than phage amplified biologically assay.Conclusion:Mycobacterium tuberculosis fluorescence quantitative PCR is of great diagnostic value in the early diagnosis of tuberculous exudative pleurisy，and phage amplified biologically assay is of certain reference value.

Key Words Polymerase chain reaction PCR;Phage amplified biologically assay;Tuberculous exudative pleurisy

結核性胸膜炎是結核分枝桿菌引起的胸膜炎癥病變。對結核性胸膜炎最具有診斷價值的細菌學檢查陽性率很低，結核性胸腔積液中抗酸桿菌涂片陽性率僅10%～20%，培養陽性率也僅25%～50%。應用PCR檢測結核桿菌DNA、噬菌體生物擴增法檢測抗酸桿菌，均對結核分枝桿菌有較高的敏感性［1］。因此使用熒光定量聚合酶鏈反應(以下簡稱熒光定量PCR)及噬菌體生物擴增法(以下簡稱PhaB)針對病原學結核分枝桿菌的檢測對早期診斷結核性滲出性胸膜炎有非常重要的意義。現將2008年1月～2011年10月采集的數據報告如下。

資料與方法

2008年1月～2011年10月收治結核性滲出性胸膜炎患者145例，男177例，女105例，年齡16～83歲，平均433±221歲。參照結核性胸膜炎的診斷標準，根據病史、臨床癥狀、體征、胸液的改變、PPD皮試等診斷為結核性滲出性胸膜炎，并經抗結核治療有效者。

方法：145例患者入院后在B超定位下行胸腔穿刺抽液術，胸液同時送檢結核分支桿菌的熒光定量PCR、PhaB檢測，根據結果比較陽性率。TB-PCR以濃度103copies/ml作為陽性定量參考。PhaB培養皿中出現大小不等的噬菌斑，且≥20個/平皿，或許多噬菌斑相互融合成透明狀判定為陽性；平皿中無噬菌斑出現或噬菌斑數量≤20個/平皿為陰性。用SPSS110系統軟件進行檢查數值。本實驗使用LightCycler熒光定量PCR儀。

結 果

145例患者中，檢測結核性胸膜炎陽性率對比。熒光定量PCR陽性77例，陽性率531%；PhaB陽性47例，陽性率324%。兩種方法聯合檢出陽性率586%。見表1。

SPSS統計軟件處理(X2)：計算P＜001差異有極顯著性。說明聚合酶鏈反應檢測明顯優于PhaB。

討 論

結核性胸膜炎是由結核分枝桿菌及其代謝產物進入處于超敏狀態的機體胸腔中所引起的胸膜炎癥。細菌學檢查是確診結核性胸膜炎的可靠標準，但臨床上通過胸液沉渣找結核分枝桿菌或結核分枝桿菌培養的陽性率很低，以及檢驗周期長等，造成對結核性胸膜炎早期診斷有一定的困難。

熒光定量PCR方法的基本原理為PCR擴增時，在加入1對引物的同時，加入1個特異性的寡核苷酸熒光探針，兩端分別標記1個報告熒光基團和1個淬滅熒光基團，由于5′端熒光基團吸收能量后，將能量轉移給臨近的3′端熒光淬滅基團(發生熒光共振能量轉移，FRET)。因此，探針完整時，檢測不到該探針5′端熒光基團發出的熒光。但在PCR擴增中，溶液中的模板變性后低溫退火時，引物與探針同時與模板結合。在引物的介導下，沿模板向前延伸至探針結合處，發生鏈的置換，Taq酶的5′-3′外切酶活性(此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響)將探針5′端連接的熒光基團從探針上切割下來，游離于反應體系中，從而脫離3′端熒光淬滅基團的屏蔽，接受光刺激發出熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。該法樣本分析周期短，從樣本采集到出示檢測報告可在3小時內完成［2］。

噬菌體生物擴增法(PhaB)乃是利用分枝桿菌噬菌體D29既能感染活的結核分枝桿菌，又能感染少數幾種快速生長的非結核分枝桿菌，并能在菌體內繼續繁殖、裂解，大量釋放D29噬菌體，迅速感染、裂解指示菌，形成噬菌斑藉以快速檢測結核分枝桿菌，也可采用PhaB技術進行藥敏試驗。繼wilson于1997年建立了PhaB技術后，該技術在臨床中得到廣泛應用，18～24小時內出現噬菌斑［3］，24～48小時可獲得結果。

從本文統計數據可以看到，熒光定量PCR檢測陽性率531%，與馬玙總結較高的陽性率52%～81%相似［4］。熒光定量PCR的靈敏度高，TangYW等認為［5］，熒光定量PCR方法敏感性可至10～100fg，甚至10fg(約相當于1個細菌的DNA量)；特異性強，與牛型分枝桿菌、偶發分枝桿菌、蟾分枝桿菌、草分枝桿菌、龜分枝桿菌、肺炎鏈球菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、腦膜炎奈瑟菌等細菌無交叉反應。檢測周期短，從樣本采集到出示檢測報告可在3小時內完成。但熒光定量PCR由于對標本、檢驗環境及操作人員的操作等要求高，存在假陽性與假陰性等問題有待解決。本文噬菌體生物擴增法陽性率則324%，與筆者所總結的胸膜活檢陽性率314%近似［6］，并無明顯的優越性；低于文獻報道545%［7］，也明顯低于本文熒光定量PCR檢測陽性率531%。由于PhaB所用的噬菌體除可感染結核分枝桿菌外，還可以感染其他幾種非結核分枝桿菌［8］，如偶然、金色、草、恥垢、堪薩斯、鳥-胞內、丁酸分枝桿菌等，這些細菌廣泛分布于自然界及人體與外界相通的腔道，可導致檢測結果假陽性；其他殺毒劑的使用也會對結果造成影響［9］。同時由地方醫院轉入我院的患者可能在當地曾使用喹諾酮類藥物或不規則抗癆，可導致胸液中的結核分枝桿菌菌量減少，從而出現假陰性。可見影響PhaB的環節較多，該法敏感性較低，但有較高的特異度，對結核性胸膜炎還是有一定的診斷價值，但不適合做單獨診斷。如果熒光定量PCR與PhaB聯檢，則陽性率586%，對早期診斷結核性胸膜炎有一定優勢。

總而言之，對胸液行結核分支桿菌熒光定量PCR檢測及PhaB檢測屬特異性檢查，技術成熟、檢驗周期短。熒光定量PCR檢測特異性強，技術成熟，是目前針對結核分枝桿菌檢測陽性率較高的方法，對早期診斷結核性滲出性胸膜炎有重要的診斷價值；PhaB敏感性較低，對結核性胸膜炎還是有一定的參考價值。

參考文獻

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