人工肝支持系統研究進展

關鍵詞 人工肝支持系統 生物型人工肝 非生物型人工肝

急性肝衰竭因肝功能嚴重受損，導致毒性物質堆積、生理功能紊亂，預后兇險。雖然內科綜合治療近年來取得了不少進展，但病死率仍高達60%～80%。肝移植是目前治療肝衰竭惟一有效手段。但是由于個體病情和供體缺乏限制了臨床使用。人工肝支持系統的研究基于肝細胞強大的再生能力，通過體外機械、理化裝置清除體內各種有害物質，代償肝臟代謝功能，使肝細胞得以再生直至自體肝臟恢復或等待機會進行肝移植，是目前治療肝衰竭的重要方法之一。由于人工肝以體外支持和功能替代為主，只能取代肝臟的部分功能，因此又被稱為人工肝支持系統(ALSS)，簡稱人工肝。近年來人工肝支持系統，基本形成非生物型人工肝(NBAL)、生物型人工肝(BAL)、混合型生物人工肝(HBALSS)等三大類十幾種方法。文章著重對各型人工肝的應用簡要綜述，并對其發展前景和存在問題進行探討。

非生物型人工肝

非生物型人工肝以血液透析、血液濾過、血液灌流、血漿置換、連續性血液凈化等血液凈化技術清除體內毒性物質，維持人體內環境穩定的技術方法。早期非生物型人工肝裝置的設計以小分子毒物血液解毒功能為主。到20世紀70年代，隨著膜材料與膜技術的發展，血液凈化治療肝病的療效有所提高。

血漿置換是國內應用最多最廣泛的非生物人工肝治療方法，它依靠血漿交換、交換輸血技術，祛除毒性物質、補充生物活性物質。傳統的血漿分離器的孔徑為0.2～0.6μm，基本上所有的血漿物質都可以透過，在清除毒物的同時丟棄了大量對人體有益的生物活性物質［1］。浙江大學醫學院附屬第一醫院應用小孔徑血漿置換器EC-4A治療重型肝炎患者，和傳統的血漿分離器PS-06比較，能保留一部分大分子物質，減少了血漿的用量(EC-4A為2500ml，傳統的血漿分離器PS-06為3000ml)。初步結果顯示小孔徑血漿分離器比傳統的血漿分離器更適合應用于血漿置換，維持血流動力穩定，提高療效［2］。

近年來連續性血液凈化技術，以緩慢的血流速度持續穩定進行溶質交換和水分清除，具有血流動力學穩定、有效地祛除細胞因子及炎性介質，可提供充分的營養支持、改善組織氧代謝、持續維持內環境穩定等優點。對于重癥肝病患者，尤其是血流動力學不穩定和嚴重高分解代謝的患者，提供了有效地治療手段。基于上述原理近年國外研制了一些系統治療肝衰竭。①分子吸附再循環系統(MARs)：該系統是1993年德國研制的非生物型人工肝系統，基于雙面嵌入白蛋白的特殊膜對血液進行透析，血液中分子量＜50000D的中、小分子能夠跨膜彌散，膜上的白蛋白的游離位點通過與血漿白蛋白競爭結合親脂性毒素將白蛋白結合毒素吸附攝取到膜的另一側，然后依濃度梯度與白蛋白透析液中的白蛋白重新配位結合，同時將毒素轉運。白蛋白透析液凈化后可循環利用［3］。MARS是非常高效的解毒系統，可部分清除芳香族氨基酸和大量清除白蛋白結合毒素，而機體需要的重要蛋白及激素又得以保留。Heemann等［4］研究指出MARS可以改善多項血清學指標，如降低血清膽紅素水平、改善腎功能指標、肝性腦病、瘙癢癥狀和血流動力學，但同時也指出MARS可以降低患者的短期(30天)病死率，而對60天后的病死率沒有影響［5］。由于MARS能有效替代肝臟的解毒功能，糾正血流動力學紊亂，對肝衰竭的并發癥和MODS有治療作用，因此目前臨床應用較廣泛。②普羅米修斯系統：該系統為費森尤斯公司和多瑙河大學聯合研制，使用的Albu-Flow濾器能透過白蛋白，而血細胞和大分子蛋白不能透過，兩個吸附裝置吸附白蛋白結合毒素，游離的白蛋白能重新進入血液循環。普羅米修斯系統是一個基于血漿分離和吸附以及高通量透析的強大的體外肝臟解毒系統［6］。多項非對照研究均指出，普羅米修斯系統在治療肝衰竭時，可以顯著改善血清結合膽紅素、膽汁酸、氨、膽堿酯酶、肌酐、尿素氮以及血pH值水平［7，8］。普羅米修斯系統的機制和療效與MARS類似，同樣可以同時清除蛋白結合毒素和水溶性毒素。但對膽紅素和尿素氮的清除，普羅米修斯系統優于MARS系統，兩者對膽汁酸的清除能力相當，而MARS系統可以改善患者的循環狀態［9，10］。非生物型側重于代償肝臟的解毒作用，其不能完全替代肝臟的合成、代謝功能。

生物型人工肝

生物型人工肝是利用人或動物的肝組織勻漿、分離的肝細胞、肝臟切片或全肝等與生物合成材料相結合的體外裝置，主要由肝細胞來源、細胞培養方式和生物反應器三要素構成。

細胞來源：①肝細胞：生物型人工肝應用系統的成功很大程度上取決于肝細胞的功能性和穩定性。由于人肝細胞功能性好，細胞生物學功能相同，特別是能夠提供同源的生物活性物質，如白蛋白、肝細胞再生因子、凝血因子等，是生物人工肝支持系統最理想的細胞材料，這些都是其他細胞材料不具備的優點。Wurm等使用小型人肝細胞為BAL裝置建立了一種獨立操作的灌注旋轉細胞培養系統，各種功能檢測結果表明這種裝置作為移植橋梁是可行的［3，11］。但人原代肝細胞體外培養生長條件苛刻、存活時間有限、增殖傳代困難，并受到捐獻器官短缺的限制，所以許多學者都轉向異種肝細胞。Poyck等比較了成年豬肝細胞(MPHs)和成人肝細胞(MHHs)的功能和代謝能力，認為MHHs高除氨能力和代謝穩定性使其成為BAL裝置最佳的細胞來源［4］。但是由于豬內源性逆轉錄病毒(PERV)基因組存在于所有豬細胞中，一直以來成為應用的最大顧慮。Fruhauf等證實了在BAL中，原代MPHs能將PERV轉移給原代人肝細胞、人HEK293細胞系及內皮細胞，且這種傳染性在短時間接觸下就能發生［5］。盡管如此，還是有許多學者對MPHs的研究給予強烈關注。②肝細胞株：由于人肝細胞或動物的原代肝細胞，存在對體外培養生長條件要求嚴格、存活時間有限、難以傳代等缺點。永生化的肝細胞株具有容易培養，無限生長、細胞間無接觸抑制、培養后能迅速達到數量要求、取之不盡等特點，所以采用肝細胞株作為生物人工肝的細胞材料備受關注。它包括C3A、HepG2等細胞系［5］。Poyck等評估了人胎兒肝細胞系cBAL111在BAL中的應用，得出cBAL111具有肝特異性功能，除氨能力主要通過谷氨酰胺酶的作用而非尿素循環［7］。包括肝腫瘤細胞株、用生化人肝細胞株、可恢復永生化肝細胞株、豬肝細胞株。但是由于肝衰竭患者免疫功能低下，清除惡性細胞的能力降低，肝細胞株的代謝功能相對較低，永生化細胞的轉移以及腫瘤基因產物的釋放入血等都使其臨床應用顧慮重重［8］。③肝干細胞：人干細胞主要分為肝源性肝干細胞、非肝源性肝干細胞。肝源性肝干細胞來源于前腸內胚層，在胚胎發育過程中以成肝細胞的形式存在，在成年哺乳動物肝內以卵圓細胞形式存在［12］。肝源性干細胞通過提高直接氧合作用、限定生物相容性微支架、器官特異性細胞模型、動態培養、細胞內外代謝狀態來模擬體內肝微環境，從而為BAL裝置開辟新的途徑［13］。簡國登等研究發現，來源于正常肝組織的CL-1細胞，惡性程度較低，分化較好，利用二次分漿技術，能夠有效防止生物反應器內肝細胞漏入患者體內，能夠有效防止生物反應器內肝細胞漏入患者體內，提示CL-1細胞在目前生物人工肝的細胞材料來源有限的情況下，不失為一種經濟安全的種子細胞來源［14］。間充質組織具有基質細胞的多系分化能力，間充質干細胞(MSCs)在不同環境中能分化為不同種類的細胞，具有干細胞的共性。Kang等利用成纖維細胞生長因子-4(FGF-4)和肝細胞生長因子(HGF)誘導人臍帶血源性MSCs分化成肝細胞，從而為肝臟疾病的細胞移植治療提供新型來源［15］。

細胞培養：目前常用的肝細胞培養方法主要是共培養、微囊化培養、球形體聚集培養和生物反應器培養等。事實共培養、微囊化培養、球形培養和生物反應器培養可以聯合應用，有研究表明，肝細胞與其他細胞共同微囊化培養比單獨微囊化細胞存活時間更長［16］。

生物反應器：生物反應器是生物人工肝的核心部分，肝功能的發揮是在生物反應器中進行的。現已研發出幾種新的反應器有很多種，如模塊式體外人工肝系統(MELS)﹑全血灌注生物型人工肝﹑Innsbruck)﹑多層PDMS(聚二甲基硅氧烷)生物反應器(MLO)、平板生物反應器﹑微槽物生物反應器等。人工肝反應器設計上，細胞體積分布分數、細胞剪應力、氧壓值是最終所關注的重要參數。經過大量的研究得出，肝細胞剪應力的閾值為0.5Pa，而細胞內氧分壓的閾值為10mmHg。即剪應力應低于0.5Pa，而氧分壓要高于10mmHg，才能保證細胞存活。在貼壁培養時還要考慮細胞支架對流場的影響，在供氧不足時可采用加多供氧毛細管數目的方法達到提高供氧［17］。

混合型人工肝

單純靠生物型人工肝臟支持治療后能存活的病例多為個案報道，病例數較少。混合型人工肝則結合了生物及非生物型人工肝優點從理論上講可以代償肝臟的全部功能。故而，HAL已經成為人工肝領域新的研究熱點。目前研發出來的HAL系統有如下幾種。

HepatAssist2000肝臟支持系統：是由Baylar設計，Vital治療公司(San Diego，CA，USA)研制開發的。它是到目前為止唯一采用人肝細胞株(HepC3A)的人工肝裝置，由4個中空纖維型生物反應器并聯而成［15，16］。HepatAssist2000目前已完成了多中心Ⅲ期臨床試驗，該系統在改善患者神經系統方面的作用是肯定的［18］。

ELAD體外肝輔助裝置(ELAD)：是由Baylar設計，Vital治療公司(San Diego，CA，USA)研制開發的。它是到目前為止唯一采用人肝細胞株(HepC3A)的人工肝裝置，由4個中空纖維型生物反應器并聯而成［11］。

HepatAssist系統：HepatAssist生物人工肝系統是目前唯一完成Ⅱ/Ⅲ期前瞻性的多中心、隨機、對照臨床試驗的生物人工肝系統［16，17］，已進行了Ⅱ/Ⅲ期臨床試驗［11］。

HALSS混合型人工肝支持系統(HALSS)：混合型人工肝支持系統(HALSS)是浙江大學醫學院附屬第一醫院李蘭娟等研制的一種混合型生物人工肝，它同樣是采用豬肝細胞作為細胞來源，細胞總量為5×109，細胞接種于中空纖維型的生物反應器中血漿分離器分離后的患者血漿流經中空纖維管的內管腔，患者血漿與豬肝細胞通過中空纖維管半透膜進行物質交換，實現肝臟支持功能。整個系統配備保溫、蠕動泵、速度控制等裝置。李蘭娟等［19］用該混合人工肝治療了15例慢性重型病毒性肝炎患者，結果發現，每次治療后患者臨床癥狀不同程度減輕，乏力、腹脹明顯改善，腹水減少。

展 望

隨著人工肝治療研究的不斷深入以及相關交叉學科的快速發展，如細胞生物技術、生物材料的發展，必能帶動在細胞源和生物反應器等方面取得突破，人工肝的性能也必然會不斷地改進與優化，同時合理地將非生物人工肝和生物活性成分相結合，構建出高效而完善的混合型生物人工肝，提高肝衰竭患者的治療效果。我們有理由相信關于人工肝治療肝衰竭方面的研究可能會在不久的將來取得突破性進展。

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