特應性皮炎皮損處金葡菌定植率及藥敏分析

摘要：目的：探討特應性皮炎(AD)皮損處病原菌分布特點，并檢測主要病原菌的藥物敏感性。方法：多中心隨機雙盲對AD患者皮損處采取微生物標本，并收取同期住院的非AD患者皮膚創傷處微生物標本，分別作AD組與對照組，標本接種于血平板、普通巧克力平板和麥康凱平板分區劃線分離培養，應用MircoScan walkaway96進行鑒定，并對所分離到的主要病原菌應用微量稀釋法測定抗菌藥物最低抑菌濃度(MIC)值，結果按美國臨床實驗室標準化研究所中的標準，耐甲氧西林用瓊脂篩選試驗證實(苯唑西林6μg/mL)。結果：于2010年9月-2011年9月從皮膚科門診343例年齡2～15歲之間AD患者皮損部位獲得331株病原菌。AD皮損處細菌檢出率為96.5％，其中金葡菌176株占53.2％，其中MRSA65株，所占金葡菌的36.9%；對照組1373例患者分離到的病原菌總1195株，革蘭陰性桿菌為主，金黃色葡萄球菌為197株，僅占所有病原菌的16.5%，其中MRSA119株，所占比例高達60.4%。AD組金黃色葡萄球菌感染率遠高于對照組(X2=133.38，P<0.001)，但MRSA所占金黃色葡萄球菌的比例卻顯著低于對照組(X2=39.263，P<0.01)。AD組金黃色葡萄球菌對四環素、克林霉素、慶大、環丙沙星、左旋氧氟沙星、阿莫西林/棒酸、亞胺培南、頭胞唑啉和復方新諾明等的耐藥率低于對照組，其中AD組MSSA菌株對紅霉素、四環素、氯霉素、克林霉素等抗生素MIC均值高于對照組。結論：金葡菌感染與AD病情密切相關，AD患者高比例的金葡菌更可能是社區獲得或源自身感染。針對金葡菌感染的AD患者，為保留萬古霉素僅用于危及生命的感染，可選用奎奴普丁/達福普汀、利福平、復方新諾明和Linezolid等敏感抗生素控制感染，防止感染灶的擴散與病情加重。

關鍵詞：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 特應性皮炎 金黃色葡萄球菌 超抗原

【中圖分類號】R4 【文獻標識碼】A 【文章編號】1008-1879(2012)08-0001-03

特應性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一種慢性、瘙癢性、炎癥性皮膚病，患者由于皮膚屏障的缺損，皮膚病變部位往往存在微生物感染性因素，常常誘發條件致病菌甚至致病菌的定植與感染，由于尚不確定的因素往往存在金黃色葡萄球菌的定植[1，2]，金黃色葡萄球菌的超抗原和毒素又可加重AD皮膚炎癥[3-5]，進一步促進皮膚及軟組織感染；近年來AD患者皮膚及軟組織金黃色葡萄球菌特別是MRSA的發病率不斷攀升引起人們的廣泛關注；同時AD患者皮膚慢性炎癥灶正成為病原菌特別是金黃色葡萄球菌也是一個重要傳染源，對控制社區獲得性感染帶來很大壓力。在亞洲許多國家AD患者金黃色葡萄球菌特別MRSA感染率很少有報到[6]。在中國，近十多年來，我國流行病學調查也顯示AD患者皮膚的細菌感染率有升高趨勢[7]，其中金黃色葡萄球菌已成為重要的病原體，但本地區AD皮膚感染菌群分布狀況、金黃色葡萄球菌在AD皮膚感染中所占地位及其在藥敏等方面生物特性尚不清楚。因此，在本研究中，進行小兒AD患者皮膚病變部位的病原菌分布特征、金黃色葡萄球菌定植率及耐藥狀況等生物學特性的研究，旨在從流行病學角度探討AD患者皮損處定值的金黃色葡萄球菌生物學特性與藥敏模式，以便利用所獲信息制定適當的控制措施。

1 材料與方法

1.1 患者與細菌分離。于2010年9月-2011年9月來本院(包括芳村、大學城、二沙和大院等四個三甲分院)皮膚科就診的患者，依據Hanifin和Rejka的AD診斷標準[8]，選取臨床上具有AD的典型癥狀和體征，年齡2～15歲的患者343名AD患者，病程1至12年；男44例(65.7％)，女23例(34.3％)；其中2～5歲29例(43.3％)，6～10歲18例(26.9％)，11～15歲14例(20.9％)；并收取同期住院、無過敏史的、年齡2～15歲的1373名非AD患者皮膚創傷微生物檢測標本，分別作AD組與對照組。首次病原菌分離記錄每位患者基本資料以及臨床診斷，先前抗生素治療，住院治療史和居住地等信息。無菌棉簽經無菌生理鹽水浸濕后，于AD組與對照組兒童皮損處反復涂擦數次，然后將棉簽投入2.5mL稀釋液中，反復振蕩，取10μL(所收集菌液的1/250)接種，所有標本均接種于血瓊脂、普通巧克力和麥康凱瓊脂板，在37℃在需氧條件下培養48h。所有菌株均進行選取擇正式鑒定板前的基本實驗以確定菌屬，其中球菌屬進行過氧化氫酶和凝固酶實驗；革蘭陰性桿菌行氧化酶實驗。

應用西門子的MicroScan Walkaway 96 system(Dade Behring，West Sacramento，CA)鑒定所分離的細菌。所有經鑒定的菌株被儲存在含有15%(vol/vol)甘油的腦心浸液肉湯。

1.2 細菌的抗生素敏感性。抗生素敏感性測定應用Siemens的MIC板(MicroScan Pos Combo 20A；MicroScan Neg MIC 30，Siemens，USA)進行。藥敏結果判定依據臨床實驗室標準化研究所指南。其中革蘭陽性球菌檢測慶大霉素，青霉素，苯唑西林，氨芐西林，頭孢唑啉，亞胺培南，環丙沙星，氯霉素，左旋氧氟沙星，紅霉素，克林霉素，四環素，復方新諾明，哌拉西林/他唑巴坦，利福平，利奈唑胺，喹奴普汀/達福普汀，阿莫西林/棒酸和萬古霉素等到抗生素；革蘭陰性桿菌檢測阿阿米卡星，慶大霉素，氨芐西林，氨芐西林/舒巴坦，哌西林，頭孢唑啉，頭胞噻肟，頭胞他啶，頭胞西丁，頭胞貢松，氯曲南，亞胺培南，環丙沙星，左旋氧氟沙星，妥布霉素，復方新諾明，替卡西林/棒酸，哌拉西林/他唑巴坦，頭胞吡肟和阿莫西林/棒酸等到抗生素。

對于葡萄球菌，用MH平板進行D-test實驗，檢測紅霉素誘導克林霉素耐藥性。所有甲氧西林耐藥株均用含4% NaCl和(6 μg/ml)oxacillin的Mueller–Hinton瓊脂平板進行瓊脂篩選試驗證實，同時用甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌株NCTC 6571與耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌株 NCTC 12493進行質控。

1.3 統計分析。數據分析使用SPSS 13.0軟件統計(SPSS 13.0 Command Syntax Reference.SPSS Inc.，Chicago，2004)，計量資料的比較采用配對t檢驗，計數資料的比較采用卡方檢驗。不同組別間的金黃色葡萄球菌耐藥性差異的顯著性評估用卡方檢驗。P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 菌群分布及構成比。從343名AD組患者皮損部位共分離培養出細菌331株，患者細菌定植率為96.5％；331株細菌中，包括金葡菌176株占53.2％，其中65株為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)占金葡菌總數的36.9%。銅綠假單胞菌22株占6.6％，大腸桿菌20株占6.0％，表葡菌17株占5.1％，肺炎克雷伯菌17株占5.1％，白色假絲酵母菌10株占3.0％，鮑曼不動桿菌9株占2.7％，其他菌60株占19.0％。同期對照組患者分離到的病原菌總1195株，以大腸埃希菌382株、銅綠假單胞菌239株、肺炎克雷伯菌205株等革蘭陰性桿菌為主，共占69.1%。金黃色葡萄球菌197株，占16.5%，MRSA119株，所占比例高達60.4%。其它菌172株，占14.4%。AD組金黃色葡萄球菌感染率遠高于對照組(X2=133.38，P=0.000)，而MRSA的比例卻顯著低于對照組(X2=39.263，P<0.01)。

2.2 金黃色葡萄球菌的抗生素耐藥率。AD組金黃色葡萄球菌所有菌株中，對青霉素和氨芐西林耐藥率>75%，產β-內酰胺酶株達91%；對紅霉素耐藥率>50%，對四環素、克林霉素和慶大霉素耐藥率>30%，環丙沙星、左旋氧氟沙星、阿莫西林/棒酸、亞胺培南、氯霉素、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢唑啉、利福平、喹奴普汀/達福普汀、復方新諾明耐藥率<30%，未見對利奈唑胺和萬古霉素耐藥的菌株。而對照組金黃色葡萄球菌所有菌株中，97%為產β-內酰胺酶株，其中對氨芐西林和青霉素耐藥率分別為97.4%和97%，對紅霉素、環丙沙星、左旋氧氟沙星、四環素、慶大霉素和克林霉素耐藥率>50%，對阿莫西林/棒酸、亞胺培南和頭孢唑啉耐藥率>30%，而對復方新諾明，氯霉素，利福平，哌拉西林/他唑巴坦，喹奴普汀/達福普汀耐藥率<30%，也未發現利奈唑胺和萬古霉素的耐藥株。具體兩組間金黃色葡萄球菌對各主要抗生素的耐藥率對比如下圖1。

依據對甲氧西林敏感性，兩組金黃色葡萄球菌分別分為甲氧西林敏感組（MSSA）與甲氧西林耐藥組(MRSA)。其中AD組有111株MSSA，MRSA為65株；對照組中197株S.aureus中，MSSA菌為76株，MRSA菌為119株。

卡方檢驗結果顯示，AD組和對照組的MSSA對氨卞西林(X2=2.443，P=0.118)、紅霉素(X2=1.572，P=0.210)、環丙沙星(X2=3.250，P=0.071)、左氧(X2=2.358，P=0.125)、慶大霉素(X2=0.171，P=0.679)、氯霉素(X2=2.093，P=0.148)、利福平(X2=0.246，P=0.620)、奎奴普丁/達福普汀、利奈唑胺和萬古霉素等抗生素的耐藥率不存在差異；然而非AD組MSSA對克林霉素(X2=5.342，P=0.021)、紅霉素(X2=3.919，P=0.048)、青霉素G(X2=4.121，P=0.042)耐藥率顯著低于AD組MSSA。其中AD組MSSA菌株對氨芐西林與青霉素G耐藥率超過75%，對紅霉素、四環素和克林霉素耐藥率<50%，對氯霉素、慶大霉素、左旋氧氟沙星、環丙沙星、利福平、哌拉西林/他唑巴坦和復方新諾明耐藥率<30%，AD組所有MSSA菌株對奎奴普丁/達福普汀、利奈唑胺和萬古霉素均敏感，AD組MSSA株相對于MRSA株，克林霉素、紅霉素和四環素的MIC50分別從0.5mg/L、0.5mg/L、4.0mg/L增加到了4.0mg/L、8.0mg/L、16.0mg/L；但對照組MSSA菌株對氨芐西林與青霉素G耐藥率超過90%，對紅霉素耐藥率為30.5%，對其余抗生素耐藥率均<30%，其中對利奈唑胺與萬古霉素全部敏感。相對于對照組MSSA菌株對慶大霉素MIC50=1.0mg/L、MIC90=8.0mg/L，AD組MSSA菌株的MIC50=16.0mg/L、MIC90=16.0mg/L，AD組MSSA菌株對慶大霉素顯著較均對照組MSSA菌株耐藥。AD組與對照組的MSSA株對各主要抗生素的敏感性見圖2。

AD組和對照組MRSA對不同抗生素耐藥率比對檢驗結果顯示，對照組MRSA對克林霉素(X2=8.454，P=0.004)、四環素(X2=4.827，P=0.028)、環丙沙星(X2=22.699，P=0.000)、左氧氟沙星(X2=24.621，P=0.000)、慶大霉素(X2=4.546，P=0.033)、紅霉素(X2=6.295，P=0.011)等抗生素的耐藥率明顯高于AD組MRSA菌株。其中AD組MRSA菌株對紅霉素、慶大霉素耐藥率超過75%，對左旋氧氟沙星、環丙沙星、四環素、克林霉素耐藥率超過50%，而對奎奴普丁/達福普汀、利福平和氯霉素耐藥率低于30%，對復方新諾明、利奈唑胺和萬古霉素尚未出現耐藥株。對照組的MRSA菌株對紅霉素、慶大霉素、左旋氧氟沙星、環丙沙星、四環素和克林霉素的耐藥率超過75%，但奎奴普丁/達福普汀、利福平、氯霉素和復方新諾明耐藥率低于30%，同樣尚無耐利奈唑胺和萬古霉素的菌株出現，具體見圖4。各主要抗生素對兩組MRSA的MIC均值、MIC范圍、MIC50、MIC90見圖3。相對于對照組的MRSA菌株，AD組的MRSA菌株表現出對奎奴普丁/達福普汀耐藥性有所升高(MIC50=1.0mg/L、MIC90=2.0mg/L)。

綜合來看，AD患者組的MRSA與MSSA菌株對奎奴普丁/達福普汀、利福平、復方新諾明、利奈唑胺和萬古霉素均非常敏感。

3 討論

特應性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一種慢性、瘙癢性、炎癥性皮膚病；繼發微生物感染，可進一步加重本病。國外報道[1-3，5]在AD皮損處，金葡菌的檢出率高達76％～100％，患者外觀正常皮膚上僅檢出率為2％～25％。金黃色葡萄球菌(簡稱金葡菌)具有分泌超抗原、溶細胞素等多種成份[3-5]。α-毒素，溶細胞素破壞局部組織，超抗原可與IgE-FcεRI結合并形成復合物，激發局部組織肥大細胞釋放組胺等炎癥介質，引起瘙癢和炎癥反應，加重病情，并在皮膚炎癥的持續和反復發作過程中起重要作用[1-4]。近十多年來，我國特別是南方地區，因氣候、環境等多因素，兒童AD發病率明顯上升，部分患者甚至出現繼發敗血癥性休克、組織壞死等嚴重并發癥[2-4]。因此，檢測并分析南方地區兒童AD患者皮損局部微生物分布及其主要病原菌的藥敏等生物學特性對防治AD感染，控制病情具有重要意義。

本研究的AD組皮損部位共分離出的331株細菌中，主要為金葡菌176株(53.2％)，陽性率略低于國外報道，卻顯著高于同期對照組所有分離的病原菌中金黃色葡萄球菌所占例16.5%，提示金葡菌感染在AD的發病及疾病的持續和反復發作過程中起著更為重要的作用。的確，AD患者正常皮膚破壞，表皮剝脫，角質層破壞，使細胞外基質(excellular matrix，ECM)蛋白如纖維結合素和層粘連蛋白得以暴露[3，5]。金葡菌細胞壁上存在與不同組織的上皮細胞起作用的蛋白，稱為微生物識別粘附基質分子的表面成分(microbial surface components recognizing adhesive matrix moleculars，MSCRAMMs)，如金葡菌蛋白A、層粘連蛋白結合蛋白A和B、纖維蛋白原結合蛋白、纖維結合素結合蛋白、膠原結合素等[5]，這些表面分子與皮膚中的ECM蛋白有高度的親和力，通過表面蛋白，金葡菌易于粘附到受損皮膚組織中，進而定植與感染；同時，局部炎癥可誘導大量前炎癥因子釋放，高水平TNF-a和T細胞生長因子上調皮膚中的層粘連蛋白和膠原，進一步增加對金葡菌的粘附[3-5]。另一方面，具有抗細菌的作用皮膚表面脂質成份(游離脂肪酸)因表皮剝脫與角質層破壞而丟失，也有利于金葡菌可侵入皮膚[8，9]。局部定值的金葡菌細胞還可以通過與角質形成細胞間的一些原纖維和無定形物質可形成細菌生物膜，導致金葡菌粘附與規避機體炎癥細胞的呑噬，而利于細菌繁殖[2-5]。金葡菌還可以分泌具有超抗原作用的外毒素，這些外毒素包括金葡菌腸毒素A-D(SEA-D)、中毒性休克綜合征毒素-1(TSST-1)及表皮剝脫毒素，它們通過激活多克隆T細胞產生外毒素特異性IgE抗體加劇和持續與AD相關的炎癥[3-5]。此外，外毒素穿過表皮破損處，還可通過傳統抗原機制激活抗原特異性T細胞或在體內誘導產生特異性IgE，使嗜堿細胞和肥大細胞脫顆粒，釋放組胺等炎癥介質，引起遲發性超敏反應，加重AD相關的炎癥[2-4]。以上因素，有利于金葡萄菌在皮損炎癥部位有效定植與增殖。近來有研究發現，AD發病時，皮膚Th2型炎癥反應環境可以促進金葡菌與纖維連接蛋白的粘連，從免疫學機制上為金葡菌與AD相關性也提供了依據[2-5]。

與對照組相比，兩組大多數金黃色葡萄球菌株均產β-內酰胺酶，因此對青霉素和氨芐青霉素耐藥率均高達90%以上；但AD組耐甲氧西林金黃色葡萄菌（MRSA）占檢出金黃色葡萄菌比率(36.9%)低于對照組60.4%。Higaki等檢測一組AD患兒頰部和鼻腔部位的葡萄球菌，結果10例AD患兒9例頰部檢出金葡菌，7例鼻腔檢出金葡菌[1-5]；健康對照組8例中僅1例頰部檢出金葡菌，鼻腔無一例檢出金葡菌，噬菌體分型技術證明鼻腔、指甲下和皮損中金葡菌類型一致；Seigaar對AD的隨訪發現，在164次AD發作中有97％與金葡菌感染有關，AD患者未受累皮膚金葡菌的分離率達70％，慢性濕疹樣皮損區為90％，滲出性皮損區為100％[2-4]。有報道顯示在本地區社區獲得性肺炎中，MRSA占檢出的金黃色葡萄菌的38%，AD組中MRSA占檢出金黃色葡萄菌比率(36.9%)與這一比例相當，提示AD患者的金黃色葡萄菌主要來源并非院內感染所致，多數可能源于自身感染或為社區獲得性。

進一步我們比較了對照組與AD組間的金黃色葡萄菌對主要抗生素的MIC均值，雖然兩組雖有一定的差異(見圖1)，但這種差異更可能是由于MRSA菌株與MSSA菌株構成比不同所致。依據對耐甲氧西林的敏感性把兩組的金葡菌進一步分為MSSA菌株組與MRSA菌株組，再行藥敏分析結果顯示：AD組的MSSA組與對照組的MSSA組相比，對紅霉素、四環素、克林霉素、氯霉素和慶大霉素的耐藥率高，而左旋氧氟沙星與環丙沙星等到氟喹諾酮類抗菌素顯示出良好的抗菌活性。MRSA菌株相對于MSSA菌株多耐現象更為多見，因為耐甲氧西林的金黃色葡萄菌對氟喹諾酮類，大環內酯類，氨基糖苷類，四環素和利福平等抗生素也常常耐藥。我們的研究結果也顯示了MRSA菌株對紅霉素、四環素、利福平、慶大霉素和氯霉素耐藥性率均超過50%，但AD組的MRSA株對紅霉素、慶大霉素、左旋氧氟沙星、環丙沙星、克林霉素、四環素和氯霉素等抗生素的耐藥率低于對照組的MRSA株。這些抗生素主要是干擾蛋白質的合成其中紅霉素、克林霉素、氯霉素主要與核糖體50S亞單位結合，抑制肽鏈的延長，從而抑制細菌生長；慶大霉素、四環素則主要與核糖體30S亞單位結合，抑制肽鏈的延長或致核糖體結構改變，致蛋白合成異常。左旋氧氟沙星、環丙沙星快速抑制DNA合成，調節DNA起始復制和翻譯的拓樸異構酶，最終阻止核糖體的蛋白合成；干擾蛋白質合成意味著細胞存活所必需的酶不能被合成，但AD組的MRSA株表現出對干擾蛋白質合成的抗生素敏感率較高是何因素，目前尚不清楚，有待進一步研究。

綜合MSSA與MRSA菌株的藥敏結果可以發現，萬古霉素保持著非常理想的抗菌活性，一直無耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌出現；同時，可能是因為臨床上應用較少，AD組與對照組的金黃色葡萄菌對利福平、復方新諾明以及新近進入臨床的利奈唑胺和喹諾普汀/達福普汀保持著極低的耐藥水平。在治療金黃色葡萄菌尤其在治療MRSA嚴重皮膚感染時，尤其是當藥敏結果尚不清楚之前，為保留萬古霉素僅用于危及生命的感染，奎奴普汀/達福普汀、利奈唑胺、利福平和復方新諾明是除萬古霉素以外最有希望的、可供選擇的、用于治療AD患者金黃色葡萄球菌皮膚重癥感染的抗生素[8，9]。

參考文獻

[1] Lebon A，Labout JA，Verbrugh HA，et al.Role of Staphylococcus aureus nasal colonization in atopic dermatitis in infants: the Generation R Study.Arch Pediatr Adolesc Med，2009，163(8):745-749

[2] Chiu LS，Ho MS，Hsu LY，et al.Prevalence and molecular characteristics of Staphylococcus aureus isolates colonizing patients with atopic dermatitis and their close contacts in Singapore.Br J Dermatol，2009，160(5):965-971

[3] Schlievert PM，Case LC，Strandberg KL，et al.Superantigen profile of Staphylococcus aureus isolates from patients with steroid-resistant atopic dermatitis.Clin Infect Dis，2008，46:1562-1567

[4] Yeung M，Balma-Mena A，Shear N，et al.Identification of major clonal complexes and toxin producing strains among Staphylococcus aureus associated with atopic dermatitis.Microbes Infect，2011，13(2):189-197

[5] Agner T.Staphylococcal-mediated worsening of atopic dermatitis: many players involved.Br J Dermatol，2010，163(6):1147

[6] 林穎，陳達燦，陳淑慧，丁常清.特應性皮炎皮損處金黃色葡萄球菌定植情況和藥敏分析.廣東醫學，2011，32(9): 1140-1142

[7] Hong SW，Kim MR，Lee EY，et al.Extracellular vesicles derived from Staphylococcus aureus induce atopic dermatitis-like skin inflammation.Allergy，2011，66(3):351-359

[8] Hon KL，Lam MC，Leung TF，et al.Clinical features associated with nasal Staphylococcus aureus colonisation in Chinese children with moderate-to-severe atopic dermatitis.Ann Acad Med Singapore，2005，34(10):602-605

[9] Hanifin JM，Cooper KD，Ho VC，et al.Guidelines of care for atopic dermatitis.J AM ACAD DERMATOL，2004，50(3):391-404